[发明专利]一种CadR基因突变体、含突变体的重组载体及其应用

说明书

本发明公开了一种CadR基因突变体，具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或与其互补的核苷酸序列。本发明的CadR基因突变体对镉有更高的响应灵敏度和特异性，含上述CadR基因突变体的重组载体及其工程菌作为镉诱导型生物传感器能够提升检测灵敏度，同时削弱其他重金属对传感器检测的影响，可以对安全标准范围内的镉进行检测；作为重组蛋白的表达载体能够以微量的镉作为诱导剂诱导目的蛋白的表达；其在镉污染监测和调控蛋白表达方面都具有应用价值。

技术领域

本发明涉及生物传感及环境污染物检测技术领域，尤其涉及一种CadR基因突变体、含突变体的重组载体及其应用。

背景技术

镉污染作为一项重要的环境风险因素，因其能在土壤及水体中快速积累并最终通过食物链进入人体且对人体产生严重健康危害而被广泛关注。因此，环境中镉的检测显得尤为重要并被视作衡量环境污染程度的一种标准，现有的原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等传统理化方法存在样品处理过程复杂、检测成本高、易产生有害副产物等缺点。

细菌由于其种群丰富度高、生长快速、成本低、易于培养以及其独特的基因操作能力等优势使其成为生物检测的理想选择。全菌生物传感器是以合适的细菌为底盘微生物，通过构建污染物响应及信号放大系统来针对环境中的特定污染物作出响应并输出信号的生物传感模式。全菌生物传感器一般由响应元件及报告元件构成，对于重金属离子的全菌生物传感器而言，其主要的工作机理是，能特异性识别重金属的响应元件(一般为金属结合蛋白)在识别到外界环境中的重金属离子后，能够与报告模块中其特异性结合的启动子结合或脱落，这时启动子后的报告基因便会启动表达，通过检测报告基因的表达便可实现整个通路的信号检测，即报告基因信号的表达量反映了环境中重金属离子的浓度，通过这样一条信号识别及输出通路即可使用全菌生物传感器来实现重金属离子的检测，利用合成生物学的方法通过替换不同重金属的特异性响应元件对通路进行改造理论上可以完成对不同重金属的特异性识别与检测。但是，由于大多数金属结合蛋白在作为响应元件时其特异性较差，同家族的金属结合蛋白往往对多种重金属离子均具有结合能力，难以形成针对特定重金属离子响应的专一性，此外，细菌体内的蛋白表达效率以及信号通路的信号放大程度等都限制了重金属全菌生物传感器的开发，导致目前开发的重金属全菌生物传感器仍具有灵敏度差、特异性低的问题，这也限制了重金属全菌生物传感器在实际环境样品检测中的应用。

因此，为了使生物传感器能够实际应用于镉含量的检测，如何提高其针对镉的特异性以及灵敏度成为关键问题，而构建在低浓度镉条件下具有高表达水平的镉敏感元件有助于解决这一问题。此外，由于在重组蛋白的表达中目前应用最广泛的是E.coli的原核表达系统，而该系统在表达重组蛋白的过程中存在表达速度过快、肽链的非正确折叠以及多肽链的疏水区存在相互作用等问题，这导致所表达的重组蛋白多以包涵体的形式存在，而无法满足获得可溶性蛋白的需求，并且E.coli表达系统通常需要以IPTG诱导重组蛋白的表达，而IPTG 的价格较昂贵，在大体积的生产发酵中使用IPTG也会使成本增加。镉敏感元件的构建可以通过添加微量镉作为诱导剂来诱导目的蛋白的表达，为实现对目的蛋白表达水平进行有效调控提供了一条可行性的途径。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种CadR基因突变体、含突变体的重组载体及其应用。

本发明提出的一种CadR基因突变体，所述基因突变体具有如SEQ ID NO:6 所示的核苷酸序列，或与其互补的核苷酸序列。

一种含所述的CadR基因突变体的重组载体，所述重组载体中还含有组成型启动子、pCadR启动子和目的基因，所述组成型启动子与CadR基因突变体可操作性地连接，且CadR基因突变体位于组成型启动子下游，所述pCadR启动子与目的基因可操作性地连接，且目的基因位于pCadR启动子下游。

其中，CadR基因是镉特异性响应蛋白CadR的编码基因，pCadR启动子是CadR 特异性启动子。