[发明专利]一种用于肿瘤治疗的肽纳米管-环二鸟苷酸复合物的制备

说明书

本发明公开了一种用于肿瘤治疗的肽纳米管‑环二鸟苷酸复合物的制备，该方法改善了环二鸟苷酸(c‑di‑GMP)的膜渗透性差和生物利用度低的问题。肽纳米管(PNT)和苯硼酸肽纳米管(PPNT)用于递送c‑di‑GMP，可增强了c‑di‑GMP在体内的免疫抗肿瘤作用。

技术领域

本发明涉及肽纳米管、苯硼酸肽纳米管分别与环二鸟苷酸复合的制备方法。肽纳米管材料可用于递送环二鸟苷酸，可增强环二鸟苷酸的免疫治疗效果，在免疫治疗领域有良好的应用前景。

背景技术

环二核苷酸，如环二鸟苷酸(c-di-GMP)、环二腺苷酸(c-di-AMP)和环鸟苷-腺苷酸(cGAMP)等，已被证明是高效的病原体相关分子模式分子，是干扰素刺激基因(STING)的天然激动剂。当环二核苷酸与干扰素刺激基因结合时，干扰素刺激基因从内质网转移到高尔基体，进而招募蛋白激酶，然后干扰素刺激基因发生磷酸化，并进一步激活核转录因子和干扰素调节因子3，诱导Type I IFN和其他促炎细胞因子的产生，从而激活抗原呈递细胞，促进肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤微环境中的浸润。因此，环二核苷酸可以作为一种很有前途的有效佐剂来触发连接天然免疫和获得性免疫，从而使癌症免疫治疗取得成功。然而，环二核苷酸的负电性、亲水性和不稳定性阻碍了其在肿瘤免疫治疗中的进一步应用。环二核苷酸上的磷酸基团限制了它进入胞浆与干扰素刺激基因结合的能力。磷酸二酯酶可以降解环二核苷酸，使得它的生物半衰期低，以致生物利用度低。

据报道，β淀粉样蛋白原纤维派生成的短肽KL-7，具有两亲性能力，允许在中性pH=7.0，通过静电、π-π堆积和疏水相互作用，经过反向平行β-折叠，自组装成两亲性肽纳米管(PNT) (Small. 2019, 1900157)。此前，肽纳米管已被证明具有良好的生物相容性，是一种良好的纳米载体。相比球形的纳米结构，细长形的纳米管结构具有高长径比，可延长血液循环和在肿瘤的滞留时间 (Biomaterials. 2018, 178, 570e582)。在肿瘤微环境中，各种肿瘤细胞由于异常的糖基化而过表达唾液酸(SA)，它被认为是癌症发展和不良预后的标志。苯硼酸与唾液酸的特异性识别，具有更高的选择性与亲和性，且不受生理和新陈代谢的影响，表现出良好的生理稳定性。以PNT和4-羧基苯硼酸为原料，通过酰胺反应，合成苯硼酸修饰的肽段(PB-KL-7)，再自组装得到苯硼酸修饰的肽纳米管(PPNT)。采用PNT、PPNT为c-di-GMP的递送载体，得到c-di-GMP-PNT和c-di-GMP-PPNT复合物。由于PNT与PPNT能够减少c-di-GMP与磷酸二酯酶接触的机率，进而降低了c-di-GMP在体内的降解速率，有效提高c-di-GMP的生物利用度，且能够在体内促进Type I IFN和IL-6炎症因子分泌，增强免疫抗肿瘤的作用。

发明内容

针对c-di-GMP作为免疫治疗佐剂存在膜渗透性差、生物利用度低等缺陷，本发明的目的是提供一种制作成本低、操作简单、细胞毒性低的c-di-GMP-PNT、c-di-GMP-PPNT复合物的制备方法，以提高c-di-GMP对肿瘤免疫治疗的活性。

本发明提供c-di-GMP-PNT、c-di-GMP-PPNT的制备方法，包括如下步骤：

(1) 合成KL-7肽：采用Fmoc固相肽方法合成KL-7 (Ac-KLAVFFAL-NH₂)肽段。KL-7肽段的N端封闭反应，以0.2 mmol KL-7为原料，反应溶剂为醋酸酐- N,N-二异丙基乙胺-N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液，体积比为5 : 1 : 50，用量为6 mL-7 mL，反应温度为室温，反应时间为15 min-25 min；KL-7肽段的裂解脱保护，以上述已封闭的0.2 mmol KL-7为原料，反应溶剂为三氟乙酸-苯甲硫醚-二巯基乙烷-苯甲醚的混合溶液，体积比为90 : 5 : 3 :2，用量为6 mL，反应温度为室温，反应时间为1.5 h-2.5 h。乙醚沉淀裂解液，用量为40 mL。