[发明专利]结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变检测方法及检测试剂盒

说明书

本申请公开了一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变检测方法及检测试剂盒。本申请中，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变的PCR引物对组和探针的混合液。所述试剂盒基于荧光PCR熔解曲线法设计，检测准确性高，一次性检测的突变位点多，不仅避免交叉污染，而且检测周期短，检测成本低。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变检测方法及检测试剂盒。

背景技术

结核病为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染性疾病。结核病主要通过飞沫传播，可侵犯人体全身多个脏器，其中以肺结核(Pulmonarytuberculosis，PTB)最多见，具有高感染率、高发病率和高致死率。在20世纪40年代至60年代，链霉素(streptomycin，SM)、异烟肼(isoniazid，INH)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、利福平(rifampicin，RIF)等抗结核药物的问世给结核病的治疗带来了希望，并使结核病疫情在很大程度得到控制，抗结核化疗药物成为人们抵抗结核病的重要武器。然而，由于抗结核治疗的不规范以及免疫抑制剂的滥用，使得耐药结核病频繁发生。

PZA酶活性的降低和丧失是MTB产生PZA耐药的主要原因，编码PZA酶的基因是pncA，全长561bp，共187个氨基酸，其突变导致了PZA酶活性的降低和丧失，使MTB对PZA产生耐药。pncA基因突变的特点是突变位点繁多且分散，几乎涵盖了整个基因，大多数为点突变，少数为插入或缺失突变。81.1％～94.1％的PZA耐药分离株存在由pncA突变所造成的pncA蛋白结构的改变，失去了将PZA转换成活性形式的能力，从而导致耐药，且pncA基因的突变和PZA耐药存在相关性，同时发现并不是所有耐药菌株都存在pncA基因突变，对PZA耐药的部分MTB菌株不存在pncA基因突变，有些MTB菌株出现pncA基因突变，但PZA酶仍然有活性，提示可能存在其他耐药机制。对pncA基因启动子序列进行测序后发现，含有野生型pncA基因的PZA耐药菌株中存在启动子序列突变，主要集中在-11(A→G)，可能是启动子序列突变导致了MTB对PZA耐药。

现有技术中，检测MTB耐药基因的方法有Xpert MTB/RIF法、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(Polymerase Chain Reaction-Single Strand ConformationPolymorphism,PCR-SSCP)法和细菌基因组DNA直接测序法(Direct Sequencing,DS)，但前两中方法检测速度较慢，检测结果存在假阴性的可能性且难以百分之百地消除。DNA直接测序法利用PCR扩增待测基因，产物纯化或克隆化，取其DNA片段直接测序，其碱基序列与标准敏感株的同一DNA片段比较异同，寻找碱基突变的位置和分布，其虽然检测准确率高，但是该方法周期长，费用大，且很容易发生交叉污染。

荧光PCR熔解曲线法一种简单快速的PCR检测方法，其主要检测原理为耐药基因的基因突变会导致DNA双链的结合力下降，从而导致相应的Tm值下降，即野生型基因有特定的Tm值而突变型基因因为结合能力下降导致Tm值发生变化，据此可以区分和检测出突变型和野生型。在技术上，荧光PCR熔解曲线法采用闭管法，即将检测样本和检测试剂集中于反应管中，在反应过程中无须打开，避免了扩增产物的污染，有利于反应后熔解曲线的分析。因此，开发一种基于荧光PCR熔解曲线法的结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变检测方法及试剂盒十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变的引物对组。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变的引物探针混合液。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变的试剂盒。