[发明专利]基于电化学信号底物放大检测核酸的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了基于电化学信号底物放大检测核酸的方法及试剂盒，包括在传感电极上修饰特异识别待测核酸的核酸探针；将传感电极与待测核酸样品杂交；然后用电化学酶通过链酶亲和反应标记的核酸捕获探针2与已与核酸探针结合的待测核酸杂交形成双链结构。与核酸捕获探针2结合的电化学酶催化底物使无电化学活性的电化学酶变为电化学活性产物，以参比电极为基准向工作电极加电压，电化学活性产物释放产生电子同时产生反应产物，通过测定电流值实现核酸检测；电化学信号的放大通过调控底物浓度和反应时间实现。该方法对试剂储存条件要求低，可在多种环境中使用，不受温度与湿度影响；与传统的固定生物分子方法相比，灵敏度高，降低样品用量具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及基于电化学信号底物放大检测核酸的方法，还涉及利用该方法检测的试剂盒。

背景技术

免疫传感，自20世纪70年代以来，特异性免疫反应与灵敏的光学或电化学转导的结合引起了人们的广泛关注。由于电化学传感技术对微型化的适应性，引起了广泛的研究努力集中在具有高灵敏度和特异性的电化学排列免疫传感器和生物芯片。构建电化学免疫传感器的关键步骤之一是选择合适的探针固定方法。最广泛使用的方法是基于微球的固定化技术当探针被物理吸附或共价结合到带磁性铁芯的聚苯乙烯微球表面。虽然这种方法灵敏度高，但这种方法不能提供具有可控空间分辨率的相关免疫试剂，从而限制了其在生物芯片中的应用。另一种替代方法是使用电聚合导体聚合物作为固定化免疫试剂的基质。在福洛斯的开创性工作之后，生物分子如酶、DNA、抗体甚至整个细胞在导电聚合物中的固定化已被广泛应用于制造生物传感器，包括免疫传感器。为提高检测灵敏度，在酶联免疫法中的抗体可以用DNA功能化的纳米结构标记，该DNA标记的功能化材料可以通过聚合酶链式反应、杂交链式反应或者滚环扩增技术实现信号放大，通过该项技术，免疫反应的灵敏度与传统的酶联免疫法相比，可以提高多个数量级。在基于DNA信号放大的酶联免疫法中，催化发夹DNA探针自组装反应和杂交链式反应的放大程度有限；聚合酶链式反应虽信号放大程度高，但是其反应过程需要严格的升温和降温过程，限制了其扩大应用。比较而言，滚环扩增放大技术具有独特的优势，它采用等温扩增，可以实现信号分子10⁵到10⁹甚至是指数数量级的放大。但是同样需要温度控制设备，因此限制了使用给地域和环境。

因此，亟需一种灵敏度高、不需要附加设备，储存条件要求低，可在多种环境中检测核酸的方法及试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于电化学信号底物放大检测核酸的方法，该方法通过在电极表面修饰核酸探针，然后与待测核酸样品杂交后再经过夹心反应与链酶亲和素化的核酸捕获探针2杂交，最后通过生物素和链酶亲和素之间的生物亲和作用将生物素化的电化学酶结合到电极表面，催化无电化学活性的底物变为电化学活性产物，从而在电极上检测；本发明的目的之二在于提供基于电化学信号检测核酸的试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于电化学信号底物放大检测核酸的方法，包括如下步骤：

1)在传感电极上修饰特异识别待测核酸的核酸探针；

2)将待测核酸片段通过微流控通道送至传感电极处，与传感电极上的核酸探针1互补配对结合；通入清洗溶液洗清洗，留下配对物质；然后与电化学酶标的核酸探针2结合，通入清洗溶液洗清洗；通入底液，使标记的电化学活性酶催化底物转化为电化学活性物质，用电化学方法进行检测；电化学信号可通过调高底液浓度或增长反应时间放大；

或者，首先将待测核酸片段用电化学酶标记，然后通过微流控通道送至传感电极处，与传感电极上的核酸探针1互补配对结合；通入清洗溶液洗清洗掉未配对物质与未反应的酶标，仅留下配对物质；通入底液，使标记的电化学活性酶催化底物转化为电化学活性物质，用电化学方法进行检测；电化学信号可通过调高底液浓度或增长反应时间放大。

本发明优选的，传感监测的灵敏度和最低检测限可由调节底物浓度或/和电化学反应时间实现调控。