[发明专利]微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法

权利要求书

1.一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

向含有L-精氨酸的底物溶液中加入经定点突变改造的人重组精氨酸酶I，在25-45℃、pH7.2-7.3的条件下搅拌反应4-6h，将精氨酸转化生成L-鸟氨酸；

所述底物溶液中含有L-精氨酸80-120g/L，磷酸吡哆醛1-3mg/L，二甲基亚砜0.1-0.2mg/L；

所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液中含有L-精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L，二甲基亚砜0.1mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在37℃、pH7.25的条件下搅拌反应4-6h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I由如下方法制备得到：

(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧为20-40％，搅拌转速180-220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20-28h；

培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1g/L；

(2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1-7.3，过均质机破碎；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8-12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱，然后加入牛凝血酶溶液进行切割，用生理盐水洗脱，收集洗脱液；将洗脱液过苯甲脒-琼脂糖凝胶树脂，除去牛凝血酶；将过完苯甲脒-琼脂糖凝胶树脂的洗脱液再过Sephadex G-150葡聚糖凝胶，收集3h-8h流出的液体。将收集的液体通过电渗析进行脱盐，收集淡水，浓缩、干燥，即生产得到人重组精氨酸酶I。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：

将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304-Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304-Pg3进行双酶切处理，将SEQ ID NO.7所示的arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。