[发明专利]微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种微生物酶法生产L‑鸟氨酸的方法，包括以下步骤：向含有L‑精氨酸的底物溶液中加入经定点突变改造的人重组精氨酸酶I，在25‑45℃、pH7.2‑7.3的条件下搅拌反应4‑6h，将精氨酸转化生成L‑鸟氨酸；所述底物溶液中含有L‑精氨酸80‑120g/L，磷酸吡哆醛1‑3mg/L，二甲基亚砜0.1‑0.2mg/L；所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明通过对精氨酸酶进行定点突变改造处理，提高了精氨酸酶的催化活性；通过构建生产菌株和优化发酵工艺，实现了对突变改造后的精氨酸酶的工业化生产；通过优化底物溶液的组成，解决了产物鸟氨酸对精氨酸酶反馈抑制的问题，提高了底物中精氨酸的浓度。

技术领域

本发明涉及氨基酸生产技术领域，具体涉及一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法。

背景技术

L-鸟氨酸(L-ornithine)是碱性氨基酸的一种，但并不参与蛋白质的合成，而是以游离态存在。在生物体内，L-鸟氨酸主要参与尿素循环，对于氨态氮的排出有重要作用。近年来，L-鸟氨酸产品的开发逐渐升温，在医药、保健领域及化学工业的应用也日益广泛，前景一致看好。

现有制备L-鸟氨酸的方法主要有提取法、化学法、微生物发酵法和酶法。其中，提取法制备L-鸟氨酸的成本太高，且提供工艺繁琐，现已很少报道；化学法合成鸟氨酸，原料来源广泛且成本低，但该法经过多步化学反应合成，收率偏低，且合成出的鸟氨酸为DL型混合物，产物的手性拆分亦给该工艺增加了难度和成本；微生物发酵法制备L-鸟氨酸是近年来主要采用的制备工艺之一，用发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但产量不高；酶法生产鸟氨酸是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸生成鸟氨酸和尿酸。

微生物酶法生产L-鸟氨酸专一性强，反应条件温和，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，但是，微生物酶法生产L-鸟氨酸所面临的主要问题有：精氨酸酶的来源受限，目前工业化生产精氨酸酶的报道相对较少；精氨酸酶的活性也有待提高；另外，产物鸟氨酸对精氨酸酶有着很强的反馈抑制作用，导致现有转化体系中底物精氨酸的浓度一般都不高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法。本发明通过对精氨酸酶进行定点突变改造处理，提高了精氨酸酶的催化活性；通过构建生产菌株和优化发酵工艺，实现了对突变改造后的精氨酸酶的工业化生产；通过优化底物溶液的组成，解决了产物鸟氨酸对精氨酸酶反馈抑制的问题，提高了底物中精氨酸的浓度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法，包括以下步骤：

向含有L-精氨酸的底物溶液中加入经定点突变改造的人重组精氨酸酶I，在25-45℃、pH7.2-7.3的条件下搅拌反应4-6h，将精氨酸转化生成L-鸟氨酸；

所述底物溶液中含有L-精氨酸80-120g/L，磷酸吡哆醛1-3mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1-0.2mg/L；

所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述底物溶液中含有L-精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1mg/L。

优选的，在37℃、pH7.25的条件下搅拌反应4-6h。

优选的，所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I由如下方法制备得到：