[发明专利]一种通过基因编辑结合物理诱变培育温敏不育系的方法

权利要求书

1.一种通过基因编辑结合物理诱变培育温敏不育系的方法，其特征在于，包括：

(1)利用基因编辑快速获取大量温敏不育系品系，通过不育起点温度评估和杂交组合筛选，从所述温敏不育品系中筛选出适合杂交育种的温敏不育系；

(2)对步骤(1)获取的适合杂交育种的温敏不育系的原种进行物理诱变，得到相应的非转基因的温敏不育系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用基因编辑快速获取温敏不育品系的方法包括以下步骤：

以温敏不育基因Os02g0214300编码区含有NGG基序的任一位点作为靶标设计引物，构建含有所述靶标表达盒的pCRISPR/Cas9载体，再将所述pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织，经过抗生素鉴定和PCR鉴定筛选阳性转基因植株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，突变位置始于所述靶标序列的5’-N20-NGG-3’结构中的NGG上游第3到4个碱基之间。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物为：

tms5-1 F：GCCGTGGAGGGCATCTCCATCGG；

tms5-1 R：AAACCCGATGGAGATGCCCTCCA。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR鉴定时所用引物为：

tms5-4 F：CGTGTTCACCCTTCCAACCT；

tms5-4 R：GCTCGTGCTCCTGACCAATC。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不育起点温度评估和杂交组合筛选包括以下步骤：

利用基因编辑获得的温敏不育系，收获T0代实现定点突变的植株的种子；

将T0代种子在长日、高温条件下种植T1代植株，通过表型观察分离出表型不育的植株种植于短日、低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得适合于杂交育种的温敏不育系。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物理诱变包括以下步骤：

对适合于杂交育种的不育系的野生型水稻种子用⁶⁰Co-γ射线辐照处理后，种植并收获种子；

连续繁殖后，对M2代植株通过表型观察分离得到不育植株，再将所述不育植株种植于短日、低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株；

经过基因序列鉴定，从所述温敏不育株中筛选出相应基因发生突变的温敏不育株，经繁殖后获得相应的非转基因的温敏不育系。

8.一种利用权利要求1所述方法分离的温敏不育系基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

9.一种根据权利要求8所述的温敏不育系基因在筛选水稻温敏不育系上的应用，其特征在于，所述温敏不育系基因使得水稻植株高温条件下表现出花粉败育，低温条件下表现为育性恢复。