[发明专利]一种通过基因编辑结合物理诱变培育温敏不育系的方法

说明书

本发明公开了一种通过基因编辑结合物理诱变培育温敏不育系的方法，属于诱变育种技术领域。该方法包括：(1)利用基因编辑快速获取大量温敏不育品系，通过不育起点温度评估和杂交组合筛选，从所述温敏不育品系中筛选出适合杂交育种的温敏不育系；(2)对步骤(1)获取的适合杂交育种的温敏不育系的原种进行物理诱变，得到相应的温敏不育系，该方法获得的温敏不育系与基因编辑的温敏不育系本质上是相同的，但属于非转基因作物，可以直接用于育种生产。本发明的方法彻底实现人工培育不带转基因成分的温敏不育系，完全规避了转基因带来的可能风险，目的性也比常规的化学诱变和物理诱变更强。

技术领域

本发明涉及诱变育种领域，特别是涉及一种通过基因编辑结合物理诱变培育温敏不育系的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一，是全世界超过一半人口的主食(Parmar et al.,2011)。随着人口增长、可耕地面积的减少、气候变化，全球粮食市场不稳定性愈加恶化，增加粮食单位面积产量已成为维护国家粮食安全的关键措施之一。

杂交水稻可以在常规优质水稻的基础上增产10-20％。根据不育系类型的不同，杂交水稻育种的主要方法是三系法和两系法。三系法使用细胞质雄性不育系和恢复系产生杂种F1代可育种子，用于粮食生产；再利用保持系与细胞质雄性不育系杂交，保留细胞质雄性不育系。然而，只有少数水稻品种可以作为恢复系和保持系，因此三系法杂交水稻的遗传多样性很低，限制了杂种优势的利用。为了解决这个问题，两系法利用环境敏感型雄性核不育系代替三系法中的细胞质雄性不育系和保持系，由于育性不再受核质互作影响，几乎所有的常规品种都可以作为恢复系，不仅使杂交配组更加自由，还避免了三系杂交稻细胞质不育的负效应和细胞质单一可能带来的潜在危险，提高了杂种优势的利用效率，使两系法在三系杂交水稻基础上再增产。此外，环境敏感型雄性核不育系一系两用，在不育的环境条件下作为不育系，在可育的环境条件下作为保持系，简化了生产程序。综上，两系法使用的不育系受细胞核基因控制，不受恢保关系限制，配组自由，比三系法更易选育出高产优质杂交稻，已成为杂交水稻育种的主要途径。

水稻两系不育系可分为光温敏、温敏、反光温敏和反温敏等类型。目前，两系杂交水稻主要通过温敏不育系来实现。温敏不育材料往往源于自然突变，出现频率非常低。因此，用传统育种手段培育温敏不育系的过程漫长，如何提高温敏不育系的培育效率已成为迫切需要解决的问题。

为了突破传统育种的局限，基因工程手段是最高效的育种手段。近年来，定点突变技术取得了突破性进展，其中，CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats and CRISPR associated 9)技术已广泛应用于各种生物中，且在水稻基因功能研究中发挥了不可替代的作用。CRISPR/Cas9技术的基本原理是通过gRNA的靶序列将Cas9蛋白引导到靶基因，Cas9蛋白在靶序列上产生双链断裂，由于有些细胞不能实现完全保真的修复，从而在修复过程随机地产生突变。利用CRISPR/Cas9技术可以快速培育温敏不育系，避免不育系的同质化，可以更大限度地利用杂种优势。同时，我们发现，同是tms5控制的温敏不育系，其不育起点温度差别也很大，说明tms5只是决定不育系的育性在高、低温下的转换，并不决定不育起点温度。而不育起点温度的高低才是决定一个温敏不育系是否可以用于育种的关键性状，不育起点温度过高或者不稳定的光温敏不育系在杂交制种时容易受环境异常变化的影响而自交结实，导致杂交制种失败，给育种带来极大的损失。由此可见，基因编辑培育温敏不育材料的效率非常高，但并不是培育出来的不育材料都可以用于杂交育种。此外，受限于严格的转基因作物监管制度，人工转基因水稻尚未有产业化种植的先例。