[发明专利]一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法

权利要求书

1.一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：烟草种子消毒：用75％酒精浸湿烟草种子60～70s，弃酒精；再用50％v/v的次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次，获得无菌烟草种子；

S2：烟草种子萌发：将步骤S1中的无菌烟草种子接种于MS培养基中暗培养2天后放置于光照培养箱中直至无菌烟草种子萌发，待萌发1周后将烟草幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养2～8周，获得烟草无菌苗；

S3：农杆菌制备：将测序验证正确的重组质粒转化进入农杆菌感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3天后，进行菌落PCR检测，鉴定出阳性菌斑；

S4：农杆菌侵染液的制备：将步骤S3中鉴定出的阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，并于28℃、220rpm振荡培养至菌液浓度达到OD＝0.6时，向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度为100μM并继续培养；当培养至OD600达0.8时，将菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液重悬菌体至OD600＝0.6,获得农杆菌侵染液备用；

S5:侵染:取步骤S2中烟草无菌苗的叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用步骤S4中的农杆菌侵染液浸泡19～21min；侵染后，从侵染液中取出叶片，将所述叶片置于两层无菌滤纸中吸干侵染液；

S6:共培养：制备表面具有无菌滤纸的共培养基，待步骤S5中的叶片表面菌液干透后，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天；

S7:除菌培养：将步骤S6中暗培养3天后的叶片转移至除菌培养基上，暗培养2周直至叶片生长出5～6cm的毛状根；

S8：筛选培养：将步骤S7中的毛状根剪下置于固体筛选培养基上，培养1周；选择生长最快的毛状根接种于液体筛选培养基中70r/min摇培2周，获得可用于基因功能检测的烟草毛状根；

S9：毛状根鉴定：取步骤S8中的可用于基因功能检测的烟草毛状根，提取其DNA进行GUS基因的PCR鉴定。

2.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S2中，所述MS培养基为：2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8；所述光照培养箱中，在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时。

3.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3中，所述测序验证正确的重组质粒为pCAMBIA1305.1-GUS；所述重组质粒转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞采用的方法优选为冻融法。

4.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3中，所述农杆菌为LBA9402、K599、R1061中的一种。

5.根据权利要求4所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3中，所述农杆菌优选为LBA9402。

6.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S4中，所述重悬液优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8。

7.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S6中，所述共培养基优选为2/3MS2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8。

8.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S7中，所述除菌培养基优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L。