[发明专利]一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法

说明书

本发明公开了一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，包括烟草种子消毒获得无菌烟草种子、烟草种子萌发获得烟草无菌苗、农杆菌制备、农杆菌侵染液的制备、侵染、共培养、除菌培养、筛选培养获得可用于基因功能检测的烟草毛状根和毛状根鉴定等步骤。本发明简单易行、周期短，8周即可获得足量毛状根，获得的毛状根可应用于烟草基因的功能鉴定(包括被转化基因表达量的检测；其他目标基因表达量的检测以及烟碱、去甲烟碱、新烟碱等烟草物质含量的检测等)；解决了传统烟草稳定植株转化从遗传转化至可用于基因功能鉴定的T1代植株需时较长，大约1年左右的时间的技术问题；比较而言，本烟草毛状根遗传转化体系显著缩短了研究周期。

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法。

背景技术

毛状根作为工具在植物次生代谢生产中被广泛应用，尤其在生产资源植物次生代谢产物方面具有独特的优势和前景。例如，白英毛状根中薯蓣皂苷元含量和积累效率是野生型白英根的4.5及10倍。蒙古黄芪毛状根总黄酮含量极显著高于对照，金铁锁毛状根组织中多种低极性皂苷含量明显高于金铁锁药材。另外，毛状根也可作为基因功能研究的有效工具，例如利用毛状根体系对查尔酮合成酶(CHS)及查尔酮异构酶(CHI)的基因功能进行研究。

烟草是我国重要的经济作物。优良烟草品种为我国烟草行业高质量发展提供了重要支撑。以基因改良为核心的品种培育是烟草品种持续更新的重要动力来源。挖掘调控烟草品质性状关键基因，解析品质形成的分子机理，对烟草品种改良意义重大。目前，烟草基因的功能研究一般都是通过烟株转基因来实现，研究周期较长，通过毛状根可以大大缩小研究周期，因此，有必要研究烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，加速烟草功能基因的研究进程。

鉴于上述情况，有必要研究一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法以解决上述技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，旨在建立一种遗传转化效率高、周期短的烟草毛状根遗传转化体系，获得的烟草毛状根可应用于烟草基因的功能鉴定。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，包括以下步骤：

S1：烟草种子消毒：用75％酒精浸湿烟草种子60～70s，弃酒精；再用50％v/v的次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次，获得无菌烟草种子；

S2：烟草种子萌发：将步骤S1中的无菌烟草种子接种于MS培养基中暗培养2天后放置于光照培养箱中直至无菌烟草种子萌发，待萌发1周后将烟草幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养4～5周，获得烟草无菌苗；

S3：农杆菌制备：将测序验证正确的重组质粒转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3天后，进行菌落PCR检测，鉴定出阳性菌斑；如为阳性，则表明重组质粒已转入农杆菌；

S4：农杆菌侵染液的制备：将步骤S3中鉴定出的阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，并于28℃、220rpm振荡培养至菌液浓度达到OD＝0.6时，向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度为100μM并继续培养；当培养至OD600达0.8时，将菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液重悬菌体至OD600＝0.6,获得农杆菌侵染液备用；

S5:侵染:取步骤S2中烟草无菌苗的叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用步骤S4中的农杆菌侵染液浸泡19～21min；侵染后，从侵染液中取出叶片，将所述叶片置于两层无菌滤纸中吸干侵染液；

S6:共培养：制备表面具有无菌滤纸的共培养基，待步骤S5中的叶片表面菌液干透后，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天；

S7:除菌培养：将步骤S6中暗培养3天后的叶片转移至除菌培养基上，暗培养2周直至叶片生长出5～6cm的毛状根；