[发明专利]一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌采用细胞表面展示方法，将耐热肠毒素融合蛋白展示于酿酒酵母菌表面。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的耐热肠毒素融合蛋白为耐热肠毒素的两个亚型STa蛋白和STb蛋白的融合蛋白，所述的STa蛋白的编码基因estA经过了定点突变。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述定点突变是将estA基因3'端含有的半胱氨酸残基TGT和TGC突变为编码丝氨酸残基AGT和AGC。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母菌为EBY100菌株，所述EBY100菌株为色氨酸、亮氨酸缺陷型菌株。

5.根据权利要求1～4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为通过Overlap PCR方法，将定点突变后的estA基因与estB基因连接，将融合基因片段连接至表面展示质粒pYD1中，构建表面展示质粒pYD1-estA-estB，将其电击转化至酿酒酵母菌中，筛选获得。

6.一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌，其特征在于，该菌株已于2021年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：M20211222，菌株分类命名为酿酒酵母 EBY100-2017 Saccharomyces cerevisiae EBY100-2017。

7.一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）STa蛋白毒性消除：进行定点突变，将estA基因3'端含有的半胱氨酸残基TGT和TGC突变为编码丝氨酸残基AGT和AGC；

（2）estA基因与estB基因连接：采用Overlap PCR的方法将步骤（1）获得的定点突变estA基因与estB基因连接，获得融合基因片段；

（3）表面展示质粒的构建：融合基因片段连接至表面展示质粒pYD1中，构建表面展示质粒pYD1-estA-estB；

（4）酿酒酵母工程菌的构建：将重组质粒pYD1-estA-estB和质粒pYD1分别通过电击转化至EBY100菌株感受态细胞中；

（5）转化子筛选：通过酵母菌质粒PCR筛选阳性转化子。

8.一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌在畜牧养殖业中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，应用于动物肠道菌群的调整及由产耐热肠毒素大肠杆菌引起的动物腹泻的特异性免疫预防。