[发明专利]一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，公开了一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌及其应用。将定点突变后的大肠杆菌耐热肠毒素（ST）estA与estB的融合基因连接至表面展示质粒pYD1中，并将其电击转化至酿酒酵母菌中，筛选获得ST酵母基因工程菌，通过免疫荧光检测，证明ST融合蛋白成功展示在酿酒酵母菌表面。动物实验证实，该工程菌不仅具有酿酒酵母菌良好的益生功能，提高肠道黏膜免疫力，而且能有效预防由产肠毒素大肠杆菌引起的动物肠道菌群失调及小肠黏膜结构损伤，对产毒素大肠杆菌引起的动物腹泻等疾病有特异性免疫预防功能。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌及其应用。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coil, ETEC）是引起动物腹泻的一种主要病原菌，给畜牧养殖业及人类健康带来了巨大危害。ETEC进入动物肠道内，定植于小肠黏膜上皮细胞，在增殖过程中产生两种肠毒素：耐热肠毒素（Heat-stable toxin,ST）和热敏肠毒素（Heat-labile toxin, LT），而ETEC产生的耐热肠毒素ST是主要致病因素且具有很强的毒性，ST能够改变小肠细胞壁的通透性，导致电解质及水流向肠腔内，最终发生类似人霍乱的水样腹泻。

ETEC对幼年的禽畜危害很大；另外，在发展中国家，ETEC可以导致儿童和旅游者严重腹泻的发生，甚至幼龄儿童的死亡。ETEC导致人及动物腹泻的机理相似，可以通过对动物模型的研究来进一步探索人类腹泻的防治机理。

近年来，针对于ETEC引起的腹泻性疾病主要以药物治疗为主，但随着抗生素使用的增加，导致动物体内药物残留及细菌产生耐药性，这使得一系列抗生素的治疗方法效果不佳，给畜牧养殖业带来巨大的经济损失。对于防治细菌性疾病，仍然是当今困扰动物养殖业的一大难题。因此，新型微生态制剂的使用将成为动物腹泻疾病预防与治疗的重要方法之一，其对于动物肠道菌群的调节及机体免疫力的提升具有积极作用。

目前应用于ETEC防治领域的疫苗包括全菌疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗。

全菌灭活疫苗虽然制作简便，但由某一地区得到的ETEC只适合当地疫情，不能被广泛应用，存在较大的局限性，且需要的菌体量非常大，影响疫苗安全性。通过纯化ETEC的菌毛蛋白制备黏附素亚单位疫苗，常利用表达菌毛抗原量高的弱毒株制备疫苗。亚单位疫苗成本费用高，操作较复杂，不适宜大范围推广使用。

基因工程疫苗已经成为目前预防ETEC最重要的方式，主要针对黏附素和肠毒素制备基因工程疫苗。孙玉昆等将K88、K99基因工程菌疫苗免疫接种妊娠母猪，在母猪分娩后测定初乳中相应抗体水平，结果表明，在初乳中含有高效价抗体，通过母乳可使仔猪产生对ETEC一定的抵抗力（孙玉昆, 顾大年, 巫爱珍, et al. 幼畜腹泻双价基因工程疫苗(K88、K99)的高密度发酵生产工艺及抗原过量表达[J]. 生物工程学报, 1990 (2): 96-101.）。Guzman-Verduzco将ST基因与LTB基因相连，产生相应的融合蛋白可被机体识别发生免疫反应，该研究没有考虑ST的毒性，没有将其去除（GUZMANVERDUZCO LM, KUPERSZTOCH YM.Fusion of Escherichia coli heat-stable enterotoxin and heat-labileenterotoxin B subunit[J]. Journal of Bacteriology, 1987, 169 (11): 5201-5208.）。