[发明专利]一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法

权利要求书

1.一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）甘蔗胚性愈伤组织的诱导：从甘蔗植株上切下甘蔗茎顶端，取幼嫩的甘蔗轮生叶片，甘蔗轮生叶片置于愈伤组织诱导培养基上，甘蔗轮生叶片为愈伤组织培养物，愈伤组织培养物在黑暗环境中培养，在30-60天后，选择活性高的淡黄色质硬的胚性愈伤组织为诱导愈伤组织，在农杆菌浸染前，将愈伤组织培养物切碎；

（2）农杆菌的活化：农杆菌培养，离心收集体外培养的农杆菌菌体，用浸染培养基重悬，获得浸染液；

（3）胚性愈伤组织的浸染：收集步骤（1）中所获得的愈伤组织培养物，将愈伤组织培养物放入步骤（2）中获得的浸染液中，在黑暗环境中轻轻摇匀，摇匀时间为0.5-2.0小时，将农杆菌悬液去除，愈伤组织转移到培养皿中，用滤纸吸干多余的农杆菌悬液，在超净工作台中，风干30分钟至表面没有水分；

（4）浸染培养：将步骤（3）中获得的浸染过的愈伤组织培养物转移到共培养基中，在28℃黑暗环境中，共培养7-10天，完成浸染的过程；

（5）浸染过的胚性愈伤组织的筛选：将步骤（4）中被浸染完成的愈伤组织培养物转移到筛选培养基中，在28±2℃黑暗环境中孵化20-40天，获得抗性愈伤组织，转入再生培养基中，在光照培养箱中培养，获得分化芽；

（6）分化再生过程：将步骤（5）中获得的抗性愈伤中分化的芽移入生根培养基中，在光照培养箱中培养20天，将每个芽中的单芽移入新鲜生根培养基中培养15-25天，即可以取抗性苗的叶片，进行分子检测分析，移栽到土壤中。

2.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（1）中，甘蔗轮生叶片的横截面为1-2 mm的薄片，愈伤组织培养物在25-28℃的黑暗环境中培养，每10-15天更换新鲜的愈伤组织诱导培养基。

3.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，农杆菌培养至对数生长期OD₆₀₀浓度0.5-1.0，浸染培养基重悬采用摇床培养，28±2℃摇床培养0.5-2.0小时，摇床培养后加入1.0-3.0% 纤维素酶R-10+0.5-1.0% 离析酶R-10+0.4-1.0%果胶酶Y-23。

4.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（5）中，光照培养箱的温度设置为28±2℃，光照强度为5000-8000Lux，培养时间为10-30天。

5.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（6）中，分子检测分析的方法可以从DNA水平和RNA水平通过PCR的方法检测外源基因是否已导入甘蔗基因组中。

6.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（6）中，分子检测分析的方法可以通过QRT-PCR的方法检测外源基因的表达量变化的情况。

7.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其特征在于：所述组织诱导培养基为：MS+ 30 g/L 蔗糖 + 2 mg/L 2,4-D + 8 mg/L 卡拉胶；

浸染培养基为：1/5 MS+30 g/L蔗糖+30 g/L葡萄糖+100m mol乙酰丁香酮；

共培养基为：MS +1.0 mg/L 2,4-D + 30 g/L 蔗糖 + 8 g/L 卡拉胶 + 200 mg/L 特美汀；

筛选培养基为：MS +2.0 mg/L 2,4-D + 8 g/L 卡拉胶 + 200 mg/L 特美汀 + 5 g 蔗糖 + 0.01-0.1% Basta；

再生培养基为：MS +1.0 mg/L 6-BA + 8 g/L 卡拉胶 +200 mg/L 特美汀 +5 g 蔗糖+ 0.01-0.1% Basta；

生根培养基为：MS + 2 mg/L NAA + 8 g/L 卡拉胶 + 300 mg/L 特美汀 + 5 g 蔗糖+ 0.01-0.1% Basta。