[发明专利]一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法

说明书

本发明是一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，其以甘蔗的茎顶端的幼嫩的轮生叶片作为外植体，诱导其产生高质量的胚性愈伤组织，以优质的胚性愈伤组织作为农杆菌侵染的受体材料。侵染过程中通过纤维素酶R‑10、离析酶R‑10和果胶酶Y‑23消化部分植物的细胞壁，并将侵染的条件设置在28℃黑暗培养7‑10天，提高转化的效率。经过20‑40天的0.01‑0.1%的除草剂抗性培养后，再进行分化培养，获得抗性转化植株后移栽。本发明是一项可以高效获得转基因甘蔗植株的转化方法，实验成本低，方法简单。

技术领域

本发明涉及甘蔗技术领域，具体涉及一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法。

背景技术

甘蔗是世界上最为重要的糖料作物，占世界产糖量约70%以上，分布在世界主要的热带和亚热带地区。它是一种遗传背景高度复杂的多倍性非整倍体植物。甘蔗是一种一年生的无性繁殖的作物，现代甘蔗栽培种中存在大量的非整倍体，其染色体数量多、基因组结构复杂，传统的杂交育种技术周期长，后代基因组高度杂合，性状的识别和筛选比较困难。另外花期长，导致的花期不遇，部分甘蔗开花难，花粉不足或活性低等都导致部分优异甘蔗无法进行杂交利用。基因工程育种技术是甘蔗传统育种工作的非常必要的有益补充，也是甘蔗品种遗传改良从分子技术入手的重要突破性途径。

甘蔗作为重要的糖料作物和遗传转化高安全级别的经济作物，其遗传转化的研究一直倍受重视。转基因技术优势包括：（1）避免了品种杂交导致的大量基因重组；（2）可通过导入其他生物体中的外源基因进行定向改良；（3）大幅度的缩短了育种周期。此外，由于甘蔗不是直接食用的，其工业加工制成蔗糖、乙醇等可以去除转基因表达的蛋白；甘蔗栽培品种在自然条件下不易开花，因此可避免花粉传播导致的非人类意愿的自然杂交。因此，在国内和国际上甘蔗转基因被认为是转基因风险最低（I 级）的转基因作物。另外，由于甘蔗可无性繁殖，因此避免了在繁殖过程中发生变异和性状分离。这一特性提高了转基因甘蔗的基因稳定性，从而缩短了育种周期并减少育种成本。所以，从转基因效益和安全2个方面考虑，甘蔗转基因技术有很大的潜在研究和商业价值。

目前应用于甘蔗中的转基因技术主要是基因枪介导法和农杆菌介导法。近年来甘蔗的转基因研究主要以新型抗病虫、抗寒、抗旱和高糖以及作为生物反应器生产高附加值产品为主，同时在转基因生物的检测研究中也取得了较大的进展。但是甘蔗的转基因还是受到一些因素的限制，转化效率低、基因表达效率不高、转基因安全性研究少以及可能存在的法律和社会问题等。建立多个甘蔗主栽品种高效、快速、稳定的遗传转化体系，研究安全型系统，开展大片段基因、多基因转化，实现基因的时空控制表达等将是甘蔗转基因技术的新的发展趋势。

转基因甘蔗的研究开始于20 世纪80 年代，早期甘蔗转基因植株的获得主要是采用基因枪转化法，但转化效率较低，嵌合体比较多，外源基因插入拷贝数比多，遗传稳定性比较差，转化成本高。1998年以来，研究者更多的采用农杆菌介导法，其优点在于外源基因插入的拷贝数低，能够实现了大片段DNA的转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，通过改进转化方法，大大提高了转化效率，节约了转化过程中的成本。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，包括以下步骤：

（1）甘蔗胚性愈伤组织的诱导：从甘蔗植株上切下甘蔗茎顶端，取幼嫩的甘蔗轮生叶片，甘蔗轮生叶片置于愈伤组织诱导培养基上，甘蔗轮生叶片为愈伤组织培养物，愈伤组织培养物在黑暗环境中培养，在30-60天后，选择活性高的淡黄色质硬的胚性愈伤组织为诱导愈伤组织，在农杆菌浸染前，将愈伤组织培养物切碎；

（2）农杆菌的活化：农杆菌培养，离心收集体外培养的农杆菌菌体，用浸染培养基重悬，获得浸染液；