[发明专利]一株产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用

说明书

本发明公开了一株产D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种启动子筛选及其RBS优化提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶表达量的方法。使用本发明提供的载体pP43NMK‑hag和pP43NMK‑hag‑RBS4构建的重组枯草芽孢杆菌，使目的基因D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的酶活得到了提高，改造后的酶活分别是原始载体的1.30倍和1.69倍。本发明还提供了一种无抗载体及一株无抗重组枯草芽孢杆菌菌株，采用本发明提供的无抗菌株B.subtilis 1A751‑dal^‑/pP43NMK‑hag‑RBS4‑dpe‑dal，其摇瓶最高发酵酶活为24.72U/mL。

技术领域

本发明涉及一株产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-allulose)是D-果糖在C-3位上的差向异构体，可以作为低热量甜味剂，并能通过美拉德反应生成令人愉悦的味道，可改善食物的凝胶性；具有降低血糖与血脂水平、减少脂肪堆积、清除活性氧(ROS)等调节生物功能。

早在2014年，美国食品药品监督管理局的法律法规将D-阿洛酮糖列为一般安全，允许将其添加在食品、膳食补充剂以及医药制剂中。因此D-阿洛酮糖在医药、食品等领域均有广泛的应用前景。

D-阿洛酮糖作为一种稀有糖，在自然界中存在量极少，直接提取并不现实。同时化学合成会生成副产物，造成分离困难，大大提高生产成本，并且复杂的反应过程会产生过度的污染。因此，目前对于D-阿洛酮糖的生产，主要采用的是生物转化法。与自然提取法和化学合成法相比，生物转化法具有反应条件温和、专一性高、对环境友好等优点。在生物转化法中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶起着关键性的作用，它可以将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。

枯草芽孢杆菌是食品级微生物(GRAS)，适合应用于工业生产。同时，它具有遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于规模扩大化培养等优点，是发酵合成D-阿洛酮糖3-差向异构酶的优势平台。

发明内容

为了解决现有技术中D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活低，在重组菌中表达量不高等的技术问题，同时为了得到一种能够在无抗体系中高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶的表达体系。本发明第一个目的是提供了一种增强目的蛋白表达量的表达载体，所述表达载体为，将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为hag、ylbP、hagP43、ylbPylbP、haghag中的任一个启动子得到的；

所述启动子hag、ylbP、hagP43、ylbPylbP、haghag的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白为D-阿洛酮糖3-差向异构酶或磷酸化糖基差向异构酶；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或如SEQ ID NO.21所示，所述磷酸化糖基差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示或如SEQ ID NO.23所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供了一种表达载体，所述表达载体为：将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag启动子，并且，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时进行突变。

在本发明的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag序列上的碱基第129位～137位的agggaggaa序列突变为：gaggaggaa(命名为R2)，或ggggaggag(命名为R4)，或agggaggag(命名为R11)，或agggagggg(命名为R13)，或aaggaggag(命名为R14)，或aaggagggg(命名为R15)。