[发明专利]脑梗塞早期诊断标志物、筛选方法及应用和脑梗塞早期诊断模型的构建方法及应用

权利要求书

1.脑梗塞诊断标志物，其特征在于，由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯、三己糖神经酰胺d18:1/18:0、溶血磷脂酰胆碱18:0、精氨酸-丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘油12:0/21:0和葡糖神经酰胺d18:0/18:0。

2.根据权利要求1所述的脑梗塞诊断标志物，其特征在于，所述脑梗塞诊断标志物为血清标志物。

3.脑梗塞诊断标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1）：收集脑梗塞患者和健康人群的血清样本，分别进行基于代谢组学和脂质组学的血清预处理；

步骤（2）：用UPLC/Q-TOF-MS平台采集血清代谢组和脂质组轮廓图谱，对图谱进行预处理，通过多变量统计分析筛选潜在的差异代谢物和脂质分子；

步骤（3）：整合步骤（2）中筛选出的代谢物和脂质分子的离子信息、加合峰信息和同位素分布信息，并结合一级和二级质谱信息，计算代谢物和脂质分子的分子量和分子式，并与代谢物数据库进行比对，确认差异代谢物和脂质分子的结构，从而得到基于代谢组学和脂质组学的脑梗塞诊断标志物；

脑梗塞诊断标志物由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯、三己糖神经酰胺d18:1/18:0、溶血磷脂酰胆碱18:0、精氨酸-丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘油12:0/21:0 和葡糖神经酰胺d18:0/18:0。

4.根据权利要求3所述的脑梗塞诊断标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中，血清预处理时，代谢组学样本采用-20℃预冷的乙腈去除血清中的蛋白：将代谢组学血清样本置于离心管中，向离心管中加入-20℃预冷的乙腈，涡旋震荡并于-20℃静置60min，之后在4℃条件下离心，离心后取上清液备用；代谢组学血清样本与乙腈的体积之比为1:4；

脂质组学样本用预冷的甲醇和甲基叔丁基醚提取血清中的脂质：将脂质组学血清样本置于离心管中，加入-20℃预冷的甲醇涡旋后，再加入甲基叔丁基醚，于摇床混匀后，加入超纯水加速分层，并于室温下静置，之后在4℃条件下离心，离心后取上清液氮气吹干，将吹干后的提取物用由异丙醇、乙腈和水混合而成的复溶混合液进行复溶，备用；脂质组学血清样本、甲醇、甲基叔丁基醚和超纯水的体积之比为1:4：10：2，异丙醇、乙腈和水的体积之比为2:1:1，复溶混合液与脂质组学血清样本的体积之比为2.5:1；

步骤（2）中，UPLC/Q-TOF-MS平台为Waters ACQUITY UPLC Xevo™ G2-XS TOF，代谢组学色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100mm，1.7μm，脂质组学色谱柱为ACQUITY UPLCCSH C18，2.1×100mm，1.7μm，在采集过程中用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量以确保实测质量的准确性和重复性；

在代谢组学的UPLC-MS分析中：流动相A为水+0.1%甲酸，即向1000 mL纯水中加入1 mLLC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相B为乙腈+0.1%甲酸，即向1000mL乙腈中加入1 mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相梯度为：0～4 min，流动相B的体积分数由5%增加到60%；4～12 min，流动相B的体积分数由60%增加到90%；12～13 min，流动相B的体积分数由90%增加到100%；13～15 min，保持流动相B的体积分数为100%不变；15～16 min，流动相B的体积分数由100%下降到5%；16～17 min，流动相B的体积分数保持为5%不变；

在脂质组学的UPLC-MS分析中：流动相A为乙腈：水=6:4 + 10mM 甲酸铵+0.1% 甲酸，即向600 mL乙腈和400 mL纯水中加入10 mmol甲酸铵和1 mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相B为异丙醇：乙腈=9:1 + 10mM 甲酸铵+0.1%甲酸，即向100 mL乙腈和900 mL异丙醇中加入10 mmol甲酸铵和1 mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相梯度为：0～4 min，流动相B的体积分数由30%增加到43%；4～4.1min，流动相B的体积分数由43%增加到50%；4.1～8 min，流动相B的体积分数由50%增加到58%；8～12 min，保持流动相B的体积分数为58%不变；12～16 min，流动相B的体积分数由58%增加到60%；16～21 min，流动相B的体积分数由60%增加到86%；21～22 min，流动相B的体积分数由86%增加到99%；22～24 min，流动相B的体积分数保持在99%不变；24～24.1min，流动相B的体积分数由99%下降到30%；24.1～26 min，流动相B的体积分数保持在30%不变；

步骤（2）中，在多变量统计分析中，主成分分析用Center方法进行归一化，正交偏最小二乘分析用Unit Variance方法进行归一化；

步骤（3）中，差异代谢物的结构鉴定使用HMDB、Lipid maps和ChemSpider三种数据库进行比对。