[发明专利]一种标记蛋白的方法

说明书

本发明公开了选择需要标记的蛋白，使用带有羧基或者硫代羧基的功能分子作为底物，使用不饱和锍盐作为羧基活化剂，在碱性缓冲溶液下，标记的蛋白发生固相肽键的生成反应；在缓冲溶液中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应和蛋白上的氨基形成特异性修饰反应；通过western blot或质谱手段鉴定特异性修饰情况。本发明使用含有羧基或硫代羧基的功能分子为底物，使用不饱和锍盐作用羧基活化剂，在不同类型的缓冲溶液中，能通过胺酯交换反应标记不同种类的各类蛋白。本发明使用安全低毒的锍盐活化酯作为标记分子，高效高选择性地可对蛋白标记，可用于基于活性的蛋白分析以及药物偶联抗体的中抗体分子的标记。

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种蛋白的标记方法，具体来说是一种通过不饱和锍盐活化羧酸，在不同生理环境的缓冲溶液下，对蛋白进行共价标记的方法。

背景技术

通过位点特异性对天然蛋白质进行共价标记是最常用的方法。相比于基因工程，其拥有实验周期更短，实验中存在不确定性因素少等优点，因而成为了更受科研工作者们青睐的蛋白质标记方法。但由于生命体的环境相对温和，因而并不是所有有机化学反应均适用于蛋白标记。因此需要注意如下几点问题：其一，蛋白质标记的化学反应必须耐受生物环境条件(pH 6-8，≤37℃，水性溶剂)；其二，蛋白质反应过程中底物浓度通常较低(μM及或nM级别)；其三，大多数在有机合成中广泛使用的保护基策略无法使用；其四，在复杂体系下保持对POI(protein of interest,POI)的高选择性。

其中，半胱氨酸是活性最高的氨基酸残基，因此也成为了迄今为止研究最广泛的蛋白质残基标记之一。但由于半胱氨酸在人类约20000种蛋白质中只有约200000个，占残基总数的1.9％，而且其中许多半胱氨酸之间形成了二硫键，这些半胱氨酸的残基便难以通过亲核反应标记。相比而言，赖氨酸残基则有650000个，占残基总数的5.9％。同时，标记半胱氨酸的各类底物包括α-卤代烃、迈克尔受体、二硫化物、异恶唑啉鎓、全氟芳基试剂和炔烃，这些化合物和硫醇之间的反应通常较为剧烈，难以区域选择性标记特定位点。而赖氨酸的平均pKa为10.5(半胱氨酸的平均pKa为8.0)，这便导致了绝大多数的赖氨酸残基在生理条件下是质子化的。因而，蛋白附近微环境的变化为特异性共价标记赖氨酸提供了潜在可能。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种标记蛋白的方法，所述的这种蛋白标记的方法要解决现有技术中蛋白标记常用的赖氨酸修饰选择性较差、修饰底物可溶性不高等问题。

本发明提供了一种蛋白标记的方法，包括如下步骤：

1)选择需要标记的蛋白，使用带有羧基或者硫代羧基的功能分子作为底物，使用不饱和锍盐作为羧基活化剂，在碱存在下，标记的蛋白发生固相肽键的生成反应；

2)在缓冲溶液中，经过不饱和锍盐活化的胺酯交换反应和蛋白上的氨基形成特异性修饰反应；

3)通过western blot或质谱手段鉴定特异性修饰情况。

进一步的，所述的用于标记的蛋白为经过纯化的蛋白、或者加入了细胞裂解液的蛋白、或者为在细胞培养环境中的蛋白中任意一种。

进一步的，所述的缓冲溶液为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙腈或者二甲基亚砜中的任意一种。

进一步的，所述的缓冲溶液可以为硼酸-氢氧化钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中的任意一种。

进一步的，所述的不饱和锍盐为α,β-或者β,γ-不饱和取代锍盐。

进一步的，所述的带有羧基或者硫代羧基的功能分子为羧酸或者硫代羧酸。