[发明专利]检测CAR-T细胞CAR阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用

说明书

本发明涉及检测CAR‑T细胞CAR阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用，属于生物医药技术领域，所述荧光融合蛋白是将CD19的部分片段与GFP进行融合，经过慢病毒转染于SupB‑1细胞中，使其再在表达WT型的CD19时，形成杂交型的CD19‑GFP蛋白，这种蛋白由于GFP的存在不能与CD81型成复合物，从而存在游离型的CD19‑GFP，用这种Sup‑B‑1细胞培养上清液与生产的CAR‑T细胞外的anti‑CD19‑scFv区进行结合，利用流式细胞仪进行488通道检测，从而能够对CAR‑T细胞CAR阳性率进行检测。与现有常用的PCR、WB、抗抗体/或荧光素酶标CD19‑流式技术，本技术无需对检测蛋白进行纯化，效率更高，成本更低。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测CAR-T细胞CAR阳性表达效率的荧光融合蛋白。

背景技术

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是一种基于体外改造T细胞，使其表面表达特异性识别肿瘤表面抗原的受体片段的癌症免疫疗法，改造后的T细胞输入患者体内，不需要抗原递呈细胞（APC）的帮助，直接靶向体内癌细胞并发挥免疫杀伤作用。对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法检测CAR转染阳性率。

CD19是B细胞表达的一种CD分子（即白细胞分化抗原），属于Ig超家族。除浆细胞外的所有B细胞系，恶性B细胞与FDC都会表达该分子。它是参与B细胞增殖、分化、活化及抗体产生的重要膜抗原，还可促进BCR的信号转导（见图1）。CD19也是CAR-T细胞识别B细胞源肿瘤细胞的重要桥梁.

绿色萤光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（GFP）指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。

在细胞生物学与分子生物学中，绿色萤光蛋白(GFP)基因常用做报告基因(reporter gene)。绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子)上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术，绿色萤光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色萤光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼（例如斑马鱼），植物，苍蝇，甚至人等哺乳动物的细胞。

CAR-T细胞治疗技术作为一种新型的癌症治疗手段，在临床上已经得到了很好的验证，同时也取得了显著的商业运营效果，其实CAR-T的制备流程复杂，质控环节众多，尤其CAR-T表达阳性率的检测作为CAR-T疗法质量控制的重要一环，目前尚无标准的检测方案。

发明内容

针对上述问题，本发明开发一种CD19胞外结构域与荧光蛋白GFP的融合蛋白细胞上清液通过流式方法进行表达效率检测的方法。与现有常用的PCR、WB、抗抗体/或荧光素酶标CD19-流式技术，本技术无需对检测蛋白进行纯化，效率更高，成本更低。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案如下：

本发明的目的一在于保护：CD19胞外结构域在用于CAR-T细胞CAR阳性表达率检测的融合蛋白构建方面的应用，所述CD19胞外结构域的氨基酸序列如SEQ NO：05或SEQ NO：06所示。

本发明的目的二在于保护：绿色荧光蛋白GFP在用于CAR-T细胞CAR阳性表达率检测的融合蛋白构建方面的应用。进一步地，将CD19胞外结构域与GFP通过GSGSGS连接构建融合蛋白，所述CD19胞外结构域的氨基酸序列如SEQ NO：05或SEQ NO：06所示。