[发明专利]一种高活性和高热稳定性的腈水合酶突变体

说明书

本发明公开了一种高活性和高热稳定性的腈水合酶突变体，属于生物工程技术领域。本发明对腈水合酶氨基酸基序中β亚基上的第50位谷氨酸突变为亮氨酸得到突变体E50L，本发明提供的突变体E50L催化烟腈的比酶活提高到353.53±22.34U/mg，比野生型提高了5.83倍。在提高酶活的同时，突变体保持了Pt NHase热稳定性良好的优势且耐受性有一定的提高。兼具较高酶活、良好热稳定性以及底物耐受性的突变体的成功构建，增强了研究者对于理性设计方法改造蛋白提高酶活的信心，进一步推动后续Pt NHase的工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种高活性和高热稳定性的腈水合酶突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术

酰胺类产品具有较高的工业价值，其中，最有代表性的产品是烟酰胺，烟酰胺是维生素B₃的一种，可以影响细胞的分化和衰老，具有抗氧化和抗炎的作用。在皮肤病学领域，烟酰胺可治疗糙皮病、痤疮、牛皮癣、色素沉着障碍等疾病；在化妆品中添加适量的烟酰胺则有减缓皮肤老化和提亮肤色的功效。酰胺类产品的传统工业生产方法为化学合成，但该方法有着反应条件苛刻、转化率低和副产物产率高的缺点。随着腈水合酶的发现和研究，条件温和、选择性强的生物催化法正逐步替代化学合成法，成功应用于工业生产烟酰胺、丙烯酰胺和5-氰基戊酰胺等酰胺类产品。

腈水合酶(nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)是一种金属酶，可以将腈类底物水合，从而转化为相应的酰胺类产物。自1985年起，第一代菌株N-774就已经被用于丙烯腈到丙烯酰胺的生物转化，这也是生物技术制造商业化学品的第一个成功案例。目前，三菱公司已经可以达到超过200000吨的丙烯酰胺年产量。

腈水合酶虽然已被用于工业生产，但由于腈的水合是放热反应，且大多数的腈水合酶在温度超过50℃时会迅速失活，两者之间的矛盾一定程度上限制了腈水合酶更广泛的应用。因此，获取兼具较高酶活和良好热稳定性的腈水合酶具有重要意义。

嗜热假诺卡氏菌Pseudonocardia thermophila JCM3095来源的耐热腈水合酶(PtNHase)在60℃处理5h仍有近90％的酶活，具有优异的热稳定性，但野生型的催化酶活较低。因此，获取兼具较好热稳定性和较高酶活的腈水合酶具有重要意义。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种来源于嗜热假诺卡氏菌P.thermophila JCM3095的腈水合酶的氨基酸基序及其在底物催化生产上的应用。

本发明的第一个目的是提供腈水合酶突变体，含有α亚基、β亚基以及调控蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

在本发明的一种实施方式中，所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

在本发明的一种实施方式中，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供所述腈水合酶突变体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒为pET-24(+)。

本发明的第五个目的是提供一种提高腈水合酶酶活力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第50位谷氨酸突变为亮氨酸。