[发明专利]脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用

权利要求书

1.一种脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)脂肪来源的间充质干细胞的制备：

小鼠AMSC和成人AMSC按常规方法分离，mAMSC和hAMSC分别采用STEMCELL^TM公司的小鼠和人MesenCult^TM扩增试剂盒再添加2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素作为完全培养基进行培养扩增，AMSC增殖接近75％融合时，进行消化、传代；

(2)TRAF3^KD修饰的AMSC的构建：

以TRAF3^KD慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-TRAF3^KD感染AMSC，TRAF3^KD修饰的mAMSC的慢病毒表达载体包含特异片段序列如SEQ:NO.1所示，包含TRAF3 mRNA的3’-UTR区的靶向结合序列，TRAF3^KD修饰的hAMSC的慢病毒表达载体包含特异片段序列如SEQ:NO.2所示；

(3)AMSC-TRAF3^KD中TRAF3表达水平分析：采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3^KD细胞中TRAF3的蛋白表达水平；

(4)在体外培养传代诱导的细胞复制衰老模型中分析天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3^KD细胞衰老表型；

(5)TRAF3^KD修饰纠正老年小鼠和代谢性疾病小鼠AMSC的衰老表型：

分离培养得到的16月龄老年小鼠AMSC(oAMSC)按步骤(2)的方法构建TRAF3^KD修饰的细胞(oAMSC-TRAF3^KD)，同样以感染空慢病毒载体的oAMSC细胞(oAMSC-Ctrl)作为对照，并分离培养6周龄年轻小鼠AMSC(yAMSC)作为比较。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)AMSC-TRAF3^KD中TRAF3表达水平分析具体步骤如下：

(a)消化离心收集细胞；

(b)采用BCA试剂盒进行蛋白定量；

(c)上样前吹走4-20％梯度浓度预制胶每孔中的甘油，细胞蛋白样本跑胶，然后转膜；

(d)再在5％BSA中封闭约1小时，然后孵育TRAF3一抗，过夜，

(e)用TBST洗膜，然后用HRP标记的抗兔二抗孵育，再用TBST洗膜；

(f)最后用ECL曝光，条带扫描后，再进行灰度比值分析，结果显示，经TRAF3^KD修饰的AMSC，其TRAF3蛋白表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSCs。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3^KD细胞的染色情况，采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3^KD细胞中p21和p16蛋白表达水平，条带采用ChemiScope Western Blot成像系统扫描后，再进行灰度比值分析。

4.权利要求1所述方法提供的TRAF3^KD修饰的AMSC在制备治疗肝脏疾病生物制剂中的应用，其特征在于，通过TRAF3^KD修饰的AMSC抵抗复制、化疗药物、辐射多种因素诱导的细胞衰老，纠正老年个体或代谢性疾病患者脂肪组织来源AMSC的细胞衰老表型，消除衰老相关的AMSC细胞功能损伤，进而提高该类AMSC的疗效。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝脏疾病包括但不限于药物或毒素诱导的急性肝损伤、肝炎、肝衰竭、肝纤维化，所述肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。