[发明专利]脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用

说明书

本发明提供脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用，是一种干预脂肪来源间充质干细胞(AMSC)衰老的修饰方法，通过表观调控TRAF3基因转录后水平的修饰策略来抑制AMSC衰老，基于该修饰可抵抗复制性衰老，化疗药物、毒素、氧化应激、辐照等诱导的细胞衰老，以及老年个体或代谢性疾病个体来源细胞本身的衰老负荷。并进一步通过小鼠肝衰竭模型等体内实验明确TRAF3^KD修饰对于提高衰老AMSC肝病疗效的作用。本发明提供的制备肝病治疗的生物制剂，其制备周期更短，并且可消除AMSC衰老相关细胞功能损伤带来的不良效应，进而提升该细胞制剂在肝病临床治疗中的应用潜能。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用，具体涉及通过表观遗传学修饰抑制TRAF3翻译来抑制脂肪来源间充质干细胞衰老，进而可提高其增殖能力和疗效的方法，并提供TRAF3^KD修饰的AMSC(AMSC-TRAF3^KD)在制备肝脏疾病治疗生物制剂中的应用。。

背景技术

肝衰竭是一类由各种病因引起的肝细胞大量坏死而导致的肝脏功能的严重损害，表现为高胆红素血症、凝血功能障碍、腹水、肝性脑病等临床症候群。在我国，乙型肝炎病毒感染是引发肝衰竭的主要因素，乙肝急性发作或慢乙肝的重症化转归均可能导致肝衰竭的发生。由于我国乙肝患者人群基数庞大，因此肝衰竭等重症肝脏疾病的人数众多。肝衰竭具有极高的病死率，严重威胁患者的健康。目前，针对肝衰竭的治疗主要以内科支持和对症治疗为主，但治疗效果常常不佳，需要配合人工肝系统或进行肝移植。而血浆及肝源短缺大大制约了人工肝系统和肝移植在肝衰竭治疗中的应用。因此，探寻有效的治疗新靶位和新方法来降低其病死率十分关键。

间充质干细胞(MSC)已被证实具有强大的分化潜能、自我更新能力、免疫调节作用以及靶向治疗功能。基于MSC的治疗手段能缓解肝脏炎症、促进肝细胞再生，已在动物实验中显示出良好的疗效。并且小样本的临床研究显示，输注MSC的耐受性良好，可显著改善肝脏功能、降低Child-Pugh和MELD评分、减少腹水及总死亡率。虽然MSC在再生医学及肝病治疗中的作用已备受肯定，但其疗效仍存在局限性。其中许多缺陷，如增殖、迁移和分化能力差等，可能与其细胞衰老有关。在MSC移植前往往需要进行体外扩增，这就为复制所诱导的细胞衰老提供了机会。此外，从老年人及代谢性疾病患者身上获取的MSCs也会具有更高的衰老负担。因此，缓解甚至抑制MSC衰老，消除衰老相关的细胞功能损伤，有望显著提高MSC移植后的治疗效果。

发明内容

本发明的目的是要提供脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法，是一种对AMSC中TRAF3进行表观遗传学抑制，并制备相应脂肪来源间充质干细胞(AMSC-TRAF3^KD)的制备方法，是一种抑制AMSC细胞衰老，提高AMSCs肝病疗效的构建方法。所述的细胞衰老包括但不限于传代扩增导致的复制性衰老，化疗药物、毒素、氧化应激、辐照等诱导的细胞衰老，老年个体或代谢性疾病个体来源细胞本身的衰老负荷。

本发明脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法通过以下技术方案实现：

1.脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备：

小鼠AMSC(mAMSC)和成人AMSC(hAMSC)按常规方法分离，mAMSC和hAMSC分别采用STEMCELL^TM公司的小鼠和人MesenCult^TM扩增试剂盒(货号：#05513，#05411)再添加2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素作为完全培养基进行培养扩增。AMSC增殖接近75％融合时，进行消化、传代。

2.TRAF3^KD修饰的AMSC的构建：