[发明专利]用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法

说明书

本发明提供了用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。其中，用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组包括一对特异性外引物F3和B3，一对特异性内引物FIP和BIP及一对环引物LF和LB，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示。利用本发明制备的荧光可视化快速检测试剂盒可实现对猫疱疹病毒I型的高灵敏度和高特异性检测，最低检测限为8 copies，同时操作简便，成本较低，设备适用范围广，适用于普通人员临床现场的快速检测，用于及时防治。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。

背景技术

猫疱疹病毒 I 型（Feline herpesvirus type 1，FHV-1）是有囊膜的双链DNA病毒，能在猫胚肾、肺以及睾丸细胞培养物内良好增殖和传代。引起的一种猫的急性、高度接触性上呼吸道疾病。

传统的FHV-1检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、血凝试验、理化特性试验和酶联免疫吸附实验（ELISA）等。目前最常用核酸检测方法有常规PCR和荧光定量PCR等。传统的FHV-1检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。PCR和Real-timePCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，需要专业技术人员，还需要有荧光定量PCR仪，且Real-time PCR试剂成本很贵，难以在基层实际生产中普及应用。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。其特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。而向LAMP反应体系中添加钙黄绿素等荧光染料，即可通过荧光信息直接实现对目标基因的快速鉴定。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于荧光PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，但其内、外引物和环引物的设计难度较大，设计不当容易造成假阴性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一组用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组，其包括一对特异性外引物F3和B3，一对特异性内引物FIP和BIP及一对环引物LF和LB，其中，所述F3和B3的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述FIP和BIP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述LF和LB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

一种用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP试剂盒，其包括如上所述的引物组。

一种用于检测猫疱疹病毒I型的荧光可视化快速检测试剂盒，其包括如上所述的引物组、2×LAMP反应缓冲液、酶溶液和荧光目视检测试剂。

进一步地，2×LAMP反应缓冲液含有：10×Thermopol buffer、MgSO₄、甜菜碱溶液、dNTPs；酶溶液为8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶溶液；荧光目视检测剂中按终浓度计含有6mmol/L MnCl₂和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液。