[发明专利]一种多能干细胞体外形成3D球的培养方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种多能干细胞体外形成3D球的培养方法，具体为：将多能干细胞在干细胞培养基中进行培养；细胞生长后，加消化液进行消化；消化结束后，移除消化液，加入成球培养基，使细胞从培养器皿的表面脱落，但仍然保持细胞团块状态；将细胞悬液转移至培养皿中继续培养；其中，所述成球培养基成分组成为：干细胞培养基；人神经调节蛋白‑1，5ng/mL～10ng/mL；青霉素‑链霉素，50U/mL～100U/mL。本发明的培养方法操作简单，极大地提高了成球效率，不需要借助外加的载体，降低了成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多能干细胞体外形成3D球的培养方法。

背景技术

多能干细胞(Pluripotent Stem Cells,PSC)包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导性多能干细胞(iPSC)。胚胎干细胞是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的，能在体外培养，具有发育多能性的干细胞。诱导性多能干细胞，是将Oct3/4、Sox2、C-Myc、Klf4四种转录因子转入成体细胞中，诱导出与胚胎干细胞性质相似的干细胞。多能干细胞具有无限扩增和体外定向分化能力，给基因功能研究、细胞基因治疗和药物筛选等领域带来了深远的影响。近年来，干细胞医疗行业成果斐然，吸引了社会各界的关注。然而，如何将多能干细胞规模化培养以增加实用性仍然是制约其发展的主要问题之一。

就目前而言，细胞培养技术主要分为两种，一种是2D细胞培养技术，另一种则是3D细胞培养技术。2D细胞培养是将细胞黏附在培养板上，在充满营养物质和细胞因子的培养基中贴壁培养。3D细胞培养则是通过特定方法让细胞形成3D球形结构，使细胞在体外进行立体式生长、分化和迁移，并形成具有一定组织特异性的三维复合结构。

传统的2D细胞培养体系虽然有很多优点，但这些模型缺乏维持原位细胞特性，无法反映细胞与细胞，细胞与基质之间的相互作用。通过纯化分离所得的原代细胞在体外2D培养之后也往往会失去其原有的功能和特性，3D细胞培养的出现很好的解决了这些问题。

多能干细胞3D培养的第一步是将多能干细胞体外形成3D球。目前让多能干细胞形成3D球的方法大概分为以下四种：第一种，将贴壁细胞消化成单细胞悬液，放入低粘附的培养皿中，让细胞自然成球；第二种，将细胞消化成单细胞悬液，加入微载体，细胞依附在微载体上，借助微载体的结构形成3D球；第三种，将细胞消化成单细胞悬液，加入细胞外基质，细胞通过细胞外基质的粘附作用形成3D球；第四种，将细胞消化成单细胞悬液，加入低粘附U底或V底96孔板中，借助离心力，让细胞聚集在底部成球。以上这四种方法存在成球效率低、操作复杂、成本高等缺点，因此寻找一种成球效率高、操作简便、成本低的3D培养方法是必要的。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种多能干细胞体外形成3D球的培养方法，能够简化操作，极大提高成球率，无需借助载体，降低培养成本。

本发明提出了一种多能干细胞体外形成3D球的培养方法：

步骤1，将多能干细胞置于培养器皿中，加入干细胞培养基进行培养；

步骤2，细胞生长后，加入消化液，进行消化；

步骤3，消化结束后，移除消化液，加入成球培养基，使细胞从培养器皿的表面脱落，但仍然保持细胞团块状态，此时形成细胞悬液；

步骤4，将细胞悬液转移至培养皿中继续培养；

其中，所述成球培养基成分组成为：干细胞培养基；人神经调节蛋白-1，5ng/mL～10ng/mL；青霉素-链霉素，50U/mL～100U/mL。

具体的，步骤2中所述细胞生长后，先将培养基移除，加洗涤液，洗涤后再加入消化液，进行消化。

具体的，所述的干细胞培养基包括重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人转化生长因子β。