[发明专利]一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测方法

权利要求书

1.一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条，其特征在于，由试纸和抗原生物素探针两部分组成；所述试纸包括支撑底板、从测试端依次固定在支撑底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及手柄端的吸水纸；所述硝酸纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫采用吸附有胶体金标记的羊抗鼠IgG的玻璃纤维棉制成；所述检测线喷涂有链霉亲和素；所述质控线喷涂有兔抗羊IgG；所述抗原生物素探针为靶标物半抗原与载体蛋白偶联后形成的靶标物人工抗原，靶标物人工抗原再与生物素偶联获得抗原生物素探针。

2.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。

3.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述抗原生物素探针的制备方法为：

第一步，取3-6mg生物素加入0.1-0.5mL DMSO中充分溶解，得混合物1；

第二步，取3-6mg EDC加入0.5mL双蒸水中充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物1的溶液中，反应30min，得混合物2；

第三步，将1-10mg靶标物人工抗原在搅拌状态下加入到混合物2的溶液中，室温反应2h后，PBS透析3d，获得抗原生物素探针。

4.一种如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)评价杂交瘤细胞分泌抗体效价

第一步，根据待测细胞板样品数目，取等量的加样孔，做好标记，分别加入5-500μg/mL的抗原生物素探针20μL/孔；

第二步，抽取细胞培养板中的细胞上清80μL/孔，分别加入第一步细胞检测板的对应孔中，混合均匀；

第三步，取出样品孔条平放于桌面上，分别插入如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，10min后观察读取结果，根据试纸条显色结果对细胞分泌抗体进行评价，筛选得到抗体阳性细胞孔；

2)评价杂交瘤细胞分泌抗体灵敏度

第一步，在不同的样品杯中分别加入靶标物抗原标准品溶液40μL/孔；

第二步，取步骤1)筛选所得抗体阳性细胞孔，用PBS稀释0-5倍后，抽取稀释后的细胞上清40μL/孔，分别加入第一步对应的样品孔中，混合均匀，反应1-3min；

第三步，向第二步样品孔中分别加入5-500μg/mL的抗原生物素探针20μL/孔；

第四步，将样品孔条平放于桌面上，插入如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，10min后观察读取结果；根据试纸条显色结果对抗体灵敏度进行评价，筛选得到灵敏度好的细胞转孔扩大培养。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述抗体效价的结果判定方法为：在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；仅在质控线处出现一条紫红色线，而检测线处不出现紫红色线，说明靶标物抗体为阴性；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明靶标物抗体为阳性；

其中检测线显色强弱与抗体滴度高低在一定范围内成正比，检测线颜色越深抗体滴度越高。

6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，评价抗体灵敏度的结果判定方法为：本检测方法基于竞争法原理，在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明样品孔中抗体与靶标物抗原不反应；若检测线颜色减弱或不出现紫红色线，说明样品孔中抗体与靶标物抗原反应；

在抗原标准品浓度固定时，检测线显色强度与抗体灵敏度成反比，检测线显色越弱则说明抗体灵敏度越好，选择检测线不显色的细胞转孔扩大培养。

7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，评价抗体灵敏度时，采用抗体浓度固定、抗原标准品浓度系列稀释时，检测线显色强度与抗原浓度呈反比，检测线消失所需抗原量越少说明抗体灵敏度越好，选择灵敏度好的细胞转孔进行下一步操作。

8.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条在制备单克隆抗体过程中检测样品中靶标物抗体中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制备单克隆抗体过程中检测样品为小鼠血清、细胞上清或腹水。