[发明专利]鉴别无籽油棕的SSR标记引物、应用及方法

说明书

本发明涉及种苗繁育技术领域，涉及一种基于与无籽相关的S‑RNase基因序列设计SSR引物、应用及利用SSR标记鉴别无籽油棕的方法，先提取油棕种苗的DNA，再进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色，即可根据电泳条带鉴别出无籽和有籽油棕。本发明所述的鉴别无籽油棕的方法，无需等到油棕树结果，在苗期即可准确鉴定出将来会产生无籽果实的油棕种苗，鉴定准确率高，能够保证油棕种苗的纯度，对于油棕种苗质量控制具有重要意义。

技术领域

本发明属于种苗繁育技术领域，涉及分子标记应用的鉴定方法，具体涉及利用SSR标记技术的应用、鉴别无籽油棕的方法。

背景技术

油棕是世界重要的油料作物，果实是唯一的产油器官，中果皮压榨得到棕榈油，种子破壳后得到种仁，种仁压榨得到棕榈仁油。目前，商业品种大多为薄壳种(Tenera)和厚壳种(Dura)，油脂压榨过程中均需要破壳工序，其中薄壳种由厚壳种和无壳种(Pisifera)杂交得来。在对油棕种质资源进行鉴定过程中，我们发现一类无籽油棕。具体表现为果实中没有种子和种壳，全部为果肉(图1)。无籽油棕在榨油过程中无需破壳工序，可以直接压榨，减少了加工成本，产油率也会相应提高。

无籽油棕品种的推广需要大量无籽油棕种苗，种苗的早期鉴定至关重要。油棕商业育苗主要采用种子育苗和组培育苗，幼苗生长3-4年才会开花结果，无籽性状才能观察到。因此，在育苗阶段鉴定种苗基因型十分必要。SSR分子标记技术步骤简单、时间短、成本低，在其他作物中也有大量成功应用的报道。在对无籽、无壳、薄壳油棕雌花转录组分析的基础上，选取可能导致无籽的S-RNase基因为目的基因，在NCBI中下载金鱼草S-RNase基因序列(HE805271.1和AJ315593.1)、茄科S-RNase基因序列(D63887.1和AB568389.1)、蔷薇科S-RNase基因序列(FJ543097.1和AF327223.1)，将这些序列与油棕基因组比对，发现与油棕KE607205.1、ASJS01098507.1、CM002081.1基因组序列相似度较高，随后用这些基因组序列在WebSat在线工具(https://bioinfo.inf.ufg.br/websat/)上设计了20对SSR引物，在华大基因合成引物，最后用于鉴别无籽油棕实验。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于与无籽相关的S-RNase基因序列设计SSR引物，应用SSR分子标记技术在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定，对于油棕种苗质量控制及种植业发展具有重要意义，在油棕种苗繁育领域应用前景广阔。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种鉴别无籽油棕的SSR标记引物，包括两对引物组，分别为P16和P19；所述P16引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述P19引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的另一目的在于提供鉴别无籽油棕的SSR标记引物在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定中的应用。

本发明的再一目的在于提供鉴别无籽油棕的方法，步骤如下：

步骤S1，取0.05-0.1g油棕叶片提取基因组DNA，稀释浓度到200ng/μl；

步骤S2，配制20ul反应体系对DNA进行PCR扩增，扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65°降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1℃，55℃退火25个循环，每个循环45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存；

步骤S3，PCR产物中加入1μl 6×染料混合，取0.8-1.0μl混合液，在6％聚丙烯酰胺凝胶上点样，电泳后银染，观察250-500bp之间的条带情况进行无籽油棕鉴定：250-500bp之间有条带的为有籽油棕(厚壳种、薄壳种、无壳种)，没有条带的为无籽油棕。