[发明专利]一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型及应用

权利要求书

1.一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型，其特征在于，所述细胞模型的构建方法为：

通过将荧光素酶小亚基连接到新冠病毒棘突蛋白的羧基端得到RBD-SmBiT标签蛋白，将荧光素酶大亚基连接到人血管紧张素酶2的氨基端得到LgBiT-ACE2标签蛋白；将含编码表达标签蛋白的质粒直接转染HEK293细胞，标签蛋白通过信号肽引导，使之跨膜分泌到培养基中，再从从细胞培养基中利用其中的组氨酸标签进行纯化。

2.根据权利要求1所述一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型，其特征在于，所述RBD-SmBiT标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型，其特征在于，所述LgBiT-ACE2标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1-3任一所述细胞模型在新冠病毒RBD和ACE2相互作用抑制剂的高通量筛选中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)含有荧光素酶亚基的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2标签蛋白底物中荧光素酶活性的滴定；将纯化的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2标签蛋白按照1：2不同的浓度梯度连续稀释到384孔板中，根据其活性确定具体实验时所用的稀释浓度；

2)利用自动分液器将稀释好的RBD-SmBiT标签蛋白加入384孔板中，每孔加10μL；

3)稀释待筛选化合物至50μM，加入5μL/孔50mM的化合物到步骤2)的384孔板中，室温下孵育30分钟，让化合物充分结合RBD-SmBiT标签蛋白；

4)在步骤3)经过孵育后的384孔板中加入稀释好的LgBiT-ACE2标签蛋白，每孔加10μL，混匀离心收集，室温反应30分钟；

5)加入25μL荧光底物，混匀离心收集，室温平衡10分钟读板。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述步骤1)具体的做法是RBD-SmBiT标签蛋白按坐标横向稀释，LgBiT-ACE2标签蛋白按纵向稀释。稀释的体积各为10μL。稀释混匀好后，加入20μL荧光底物检测荧光素酶的活性。