[发明专利]一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型及应用

说明书

本发明公开了一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型及应用，采用NanoBiT荧光素酶互补原理，在ACE2蛋白的氨基端和RBD羧基端分别接入荧光素大小亚基，两者互补得到有功能的可催化荧光底物发光的功能性复合物。利用该方法检测蛋白抑制剂活性具有灵敏，快捷，信号强、可逆、干扰小、检测方便和成本可控等优点。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型及应用。

背景技术

新型冠状病毒通过病毒包膜上棘突蛋白(S蛋白)(RBD)与人血管紧张素转化酶2(ACE2)结合进而侵染细胞，达到传播的目的。因此RBD和ACE2的相互作用就成为了筛选抑制新型冠状病毒传播的药物靶点。

目前针对于ACE2和RBD相互作用为药物靶点的药物筛选方法有：(1)等温滴定量热法(ITC)和表面等离子体共振(SPR)。这些方法存在的问题是无法进行大规模高通量筛选。(2)荧光共振能量转移(FRET)、饱和转移差(STD)NMR、免疫共沉淀和微尺度热电泳法。这些方法存在的问题是在实验过程中，确定实验条件有些难度，实行起来不是很方便。(3)AlphaLISA法。该方法存在的问题是易受环境氧的干扰。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型及应用。本发明采用的是NanoBiT荧光素酶互补原理，在ACE2蛋白的氨基端和RBD羧基端分别接入荧光素大小亚基，两者互补得到有功能的可催化荧光底物发光的功能性复合物。利用该方法检测蛋白抑制剂活性具有灵敏，快捷，信号强、可逆、干扰小、检测方便和成本可控等优点。

一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型，所述细胞模型的构建方法为：

通过将荧光素酶小亚基(SmBiT)连接到RBD羧基端得到RBD-SmBiT标签蛋白，将荧光素酶大亚基(LgBIT)连接到ACE2氨基端得到LgBiT-ACE2标签蛋白；将含编码表达标签蛋白的质粒直接转染HEK293细胞，标签蛋白通过信号肽引导，使之跨膜分泌到培养基中，再从从细胞培养基中利用其中的组氨酸标签进行纯化。

进一步的，所述RBD-SmBiT标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述LgBiT-ACE2标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述细胞模型在新冠病毒RBD和ACE2相互作用抑制剂的高通量筛选中的应用，具体包括以下步骤：

1)含有荧光素酶亚基的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2标签蛋白底物中荧光素酶活性的滴定；将纯化的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2标签蛋白按照1：2不同的浓度梯度连续稀释到384孔板中，根据其活性确定具体实验时所用的稀释浓度；

2)利用自动分液器将稀释好的RBD-SmBiT标签蛋白加入384孔板中，每孔加10μL；

3)稀释待筛选化合物至50μM，加入5μL/孔50mM的化合物到步骤2)的384孔板中，室温下孵育30分钟，让化合物充分结合RBD-SmBiT标签蛋白；

4)在步骤3)经过孵育后的384孔板中加入稀释好的LgBiT-ACE2标签蛋白，每孔加10μL，混匀离心收集，室温反应30分钟；

5)加入25μL荧光底物，混匀离心收集，室温平衡10分钟读板。

进一步的，所述步骤1)具体的做法是RBD-SmBiT标签蛋白按坐标横向稀释，LgBiT-ACE2标签蛋白按纵向稀释。稀释的体积各为10μL。稀释混匀好后，加入20μL荧光底物检测荧光素酶的活性。

有益效果