[发明专利]以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用

权利要求书

1.以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株，其特征在于，通过对B型流感病毒减毒株B/Yamagata/16/88的NS1基因片段截短保留110个氨基酸后，将其插入到基因合成的新冠病毒参考株S蛋白上的受体结合域基因片段中，构建重组质粒NS110-RBD；利用反向遗传学技术和重组质粒NS110-RBD拯救出以B型流感病毒减毒株B/Yamagata/16/88为骨架、稳定表达新冠病毒参考株S蛋白上的受体结合域基因片段的重组流感病毒拯救株rIBV-NS110-RBD。

2.根据权利要求1所述的以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株，其特征在于，所述对B型流感病毒减毒株B/Yamagata/16/88的NS1基因片段截短保留110个氨基酸后，所获得的截短片段的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株，其特征在于，所述基因合成的新冠病毒参考株S蛋白上的受体结合域基因片段的序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株，其特征在于，所述重组质粒NS110-RBD的序列如SEQ ID NO:3所示。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、重组质粒NS110-RBD的构建；

步骤二、重组流感病毒的拯救及毒种制备。

6.根据权利要求5所述的以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株的构建方法，其特征在于，步骤一的具体操作过程如下：

(1)基因合成和引物设计

根据GenBank上公布的新型冠状病毒Spike RBD原始参考基因组序列设计上下游引物，将新型冠状病毒Spike RBD原始参考基因组序列和引物进行基因合成，获得RBD目的基因片段，引物信息如下：

InFusion-RBD-F(5’-3’)：TTTAGAGTCCAACCAACAGAAT；

InFusion-RBD-R(5’-3’)：GAAATTGACACATTTGTTTTTAAC；

InFusion-Vector-F(5’-3’)：AGCAGAAGCAGAGGATTTGTTT；

In Fusion-Vector-R(5’-3’)：AGTAGTAACAAGAGGATTTTTATTTTAAATT CACAA；

(2)目的基因片段的扩增

以合成后的RBD目的基因片段为模板，用引物In Fusion-RBD-F/In Fusion-RBD-R进行PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，进行目的基因片段的凝胶回收纯化；

(3)线性化载体NS110的扩增

以B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台中的PBD-NS110质粒为模板，用引物In Fusion-Vector-F/In Fusion-Vector-R进行PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，进行载体片段的凝胶回收纯化；

(4)构建重组质粒NS110-RBD

取扩增纯化后的目的基因片段和线性化的载体片段与去离子水混合，共同孵育后，取重组产物转化至JM109感受态细胞；通过菌落PCR筛选，对含有目的基因片段的单克隆菌落进行扩增、纯化、测序鉴定；

所得目的基因片段的扩增产物序列如SEQ ID NO:2所示；所构建的重组质粒NS110-RBD的序列如SEQ ID NO:3所示。