[发明专利]以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用

说明书

以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用，涉及新型冠状病毒疫苗领域，通过对B型流感病毒减毒株B/Yamagata/16/88的NS1基因片段截短保留110个氨基酸后，将其插入到基因合成的新冠病毒参考株S蛋白上的受体结合域基因片段中，构建重组质粒NS110‑RBD；利用反向遗传学技术拯救出以B型流感病毒减毒株B/Yamagata/16/88为骨架、稳定表达新冠病毒参考株S蛋白上的受体结合域(RBD)基因片段的重组流感病毒拯救株rIBV‑NS110‑RBD。本发明为B型流感病毒包装机制的研究和新型冠状病毒和新型流感病毒多联疫苗的研发奠定基础。

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒疫苗技术领域，具体涉及以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒在全球引发了严重的新型冠状病毒肺炎疫情，并于2020年3月被宣布为大流行。根据世界卫生组织(WHO)数据显示，截止到2021年10月，全球超过200多个国家已经报道了235,673,032例确诊病例，其中包括4,814,651例死亡病例。

新型冠状病毒(SARS-COV-2)是引起新型冠状病毒肺炎的主要病原体，与另外两种感染人的冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV同属冠状病毒科，β冠状病毒属。新型冠状病毒是一种包膜的、正向、单链RNA病毒，基因组为29903nts，由核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)以及刺突蛋白(S)组成的外膜包覆着。与SARS-CoV一样，新型冠状病毒的S蛋白通过受体结合结构域(RBD)与它们共同的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，介导病毒进入宿主细胞。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶(比如TMPRSS2)切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，并从融合前状态转变为融合后状态。S蛋白是一种I型融合蛋白，在病毒粒子表面形成三聚体，S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2，S1和S2由胞外结构域(ECD)和单个跨膜螺旋组成，分别介导受体结合和膜融合。其中S1负责与宿主细胞受体结合，S2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。S1由N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)组成，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要。S蛋白不但决定病毒的传染性及其在宿主中的传播性，也是诱导保护性免疫反应的主要抗原。因此，目前所有正在开发的疫苗主要都以RBD作为靶点。

当新型冠状病毒的基因序列在2020年1月初被公布以后，针对其疫苗的研发就开始了，并以前所未有的速度发展。目前已有200多种疫苗处于不同的研发阶段，疫苗种类主要可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗、mRNA疫苗和病毒载体疫苗。介于疫情的严重性，WHO相继将辉瑞-Biontech、阿斯利康、强生疫苗、Modenra疫苗和国药灭活疫苗列入紧急使用清单。在中和抗体方面，灭活疫苗处于低端，ChAdOx1和mRNA候选疫苗处于中等范围，重组蛋白疫苗候选疫苗处于高端，产生的中和抗体滴度最高。在耐受性方面，灭活疫苗和重组蛋白疫苗表现相对较好，其次是mRNA疫苗和腺病毒载体疫苗，在第二次免疫接种后显示出更高的免疫原性。在实用性方面，mRNA疫苗存在成本造价高、运输及储存困难等问题。

迄今为止，针对新型冠状病毒还没有有效的治疗方法，新型冠状病毒疫苗仍然是防控病毒的有效手段。现阶段新型冠状病毒疫苗临床数据表明其具有安全性和有效性，但仍然不能满足应对新型冠状肺炎疫情的要求。因此，迫切需要研制一种更加安全有效的新型冠状病毒疫苗。

A型流感病毒(InfluenzaAvirus，IAV)宿主广泛，但是B型流感病毒(IBV)主要在人群中流行，也有海豹感染的报道。与A型流感病毒一样，B型流感病毒也不断地经历抗原漂移，但进化速度低于A型流感病毒，并且不同B型流感病毒株之间有规律的重新组合。到目前为止，B型流感病毒主要分为Victoria和Yamagata两个谱系。它们与早期的B/Lee/1940流感病毒不同，这两种谱系流感病毒自20世纪80年代以来一直在人类群体中共同传播流行，是每三年一次的主要流行毒株。此外，在过去十年中，B型流感病毒引起了学校和社会的几次急性呼吸道疾病暴发，以及继发性细菌性肺炎感染。B型流感病毒的有效传播和缺乏抗病毒效果加剧了人们对其健康的担忧。