[发明专利]CL7蛋白质、高活性重组TET酶CL7-NgTET1、其原核表达载体及应用

说明书

本发明提供一种屏蔽核酸酶活性的CL7蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。还公开了一种高活性重组TET酶CL7‑NgTET1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，及其原核表达载体，其结构为：pET28A‑N6H‑MBP‑CL7‑NgTET1，还公开了其在酶转化法检测DNA甲基化中的应用。本发明在NgTET1基础上进行了设计和改造，通过融合CL7 domain获得了CL7‑NgTET1重组融合蛋白。该重组融合蛋白能够显著提高TET蛋白对5mC的氧化能力，提高了该酶的体外生物活力。通过在载体N端引入MBP融合蛋白，可在原核系统中表达，从而极大提高可溶蛋白的产量，从而同时解决了TET酶产量低和酶活低的问题，也极大缩短了生产周期及降低成本。

技术领域

本发明专利涉及一种CL7蛋白质、高活性重组TET酶CL7-NgTET1、其原核表达载体及应用，属于生物技术领域。

背景技术

DNA羟甲基化酶，Ten Eleven Translocase(以下简称TET)是真核生物中普遍存在的一种α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶，在生物进化过程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化过程的关键蛋白，可以将5mC通过三步氧化反应(5mC-5hmC-5fC-5caC)转变成5caC。现有主要的TET酶包括：鼠源mTET1/2、人源hTET1/2、NgTET1等及其系列突变、截短或融合。

其中具有较高功能活性的重组鼠源和人源TET酶主要通过人293系列细胞获得，却难以在原核细胞中表达，因此也极大限制了该酶的产量问题和极大提高了生产成本及产出周期。而重组NgTET1以往观点认为其在体外反应时，对5mC的氧化能力相对较低，因而在体外单酶生产及应用方面该酶的深度开发程度相对较低。

Yeasen公司在获得重组NgTET1在大肠杆菌中高表达后，自研的5mC酶法转化试剂盒检测到其较好的甲基化胞嘧啶的转化效率，但仍相对低于行业顶尖标准。对于严格要求甲基化检出的肿瘤早筛等应用市场，低转化意味着低效率和低准确性，原活性的NgTET1应用前景有限。因此，基于行业痛点和公司实验室基础，本发明对NgTET1引入了ColE7的改造。

ColE7(以下简称CL7)是来源于大肠杆菌素的核酸酶domain蛋白，其良好的与核酸结合能力，近期被用来进行突变改造屏蔽其核酸酶活性后与人造重组蛋白进行融合，从而提高蛋白某方面的生物活性。例如，Y Wang等对Taq DNA polymerase的改造，提高了其DNA扩增的能力。也有通过其与Im7特异结合的机理来生产层析用填料，用作一步高效的亲和蛋白纯化(Dmitry G.Vassylyev，2017 Efficient,ultra-high affinity chromatographyin a one-step purification of complex proteins)。

发明内容

本发明的目的是提供一种CL7蛋白质，以及其在提高TET酶NgTET1的活性中的应用。

本发明采用的技术方案为：一种CL7蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还公开了一种高活性重组TET酶CL7-NgTET1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，野生型NgTET1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还公开了上述的高活性重组TET酶CL7-NgTET1的原核表达载体，其特征在于其结构为：pET28A-N6H-MBP-CL7-NgTET1，其中N6H为N端His标签，MBP编码SEQ ID NO：3所示的MBP融合蛋白。

优选的，N6H与MBP之间通过linker连接，所述linker的具体序列为AGCAGCGGCTTTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT。

优选的，MBP与CL7-NgTET1之间设有TEV蛋白酶位点，其核酸序列为ATCTGTATTTTCAGGGT。