[发明专利]一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产多杀菌素J/L的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以刺糖多孢菌QL-1为出发菌株，通过插入crRNA抑制刺糖多孢菌QL-1的spnK基因表达至失活，构建得到。

2.如权利要求1所述的高产多杀菌素J/L的工程菌，其特征在于，所述spnK基因如SEQID NO.1所示，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述的高产多杀菌素J/L的工程菌的构建方法，其特征在于，是以spnK基因作为靶基因，采用CRISPR/ddCpf1技术设计抑制刺糖多孢菌QL-1的spnK基因表达的crRNA，然后将crRNA连接至表达质粒上，再转化大肠杆菌得到大肠杆菌转化子，最后将大肠杆菌转化子接合转移至刺糖多孢菌中，检测发酵产物后获得。

4.如权利要求3所述的高产多杀菌素J/L的工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)以spnK基因作为靶基因，在开放阅读框内搜索Cpf1的原间隔序列临近基序识别靶基因序列的TTTN或TTN，选取原间隔序列临近基序之后的23个核苷酸为原间隔序列，即得到抑制刺糖多孢菌QL-1的spnK基因表达的crRNA；

(2)采用直接合成法或引物退火法将步骤(1)所述crRNA连接到含有ddCpf1编码基因的质粒载体pQL-2上，得到重组质粒pQL-spnK-crRNA；

(3)将构建好的重组质粒pQL-spnK-crRNA转化大肠杆菌感受态细胞，得到大肠杆菌转化子菌液；

(4)将大肠杆菌转化子菌液与刺糖多孢菌的菌丝悬液混合后涂R6平板培养基，培养6～10天后选择接合子进行培养，经筛选后获得高产多杀菌素J/L的基因工程菌，记为QL-1/pQL-spnK-crRNA。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述直接合成法的具体步骤如下：按照crRNA的序列采用同源重组方法合成含有crRNA的插入序列(含有SpeI酶切位点)，再将含有crRNA的插入序列连接至质粒载体pQL-2的speI酶切位点处，得到重组质粒pQL-spnK-crRNA。

6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述引物退火法的具体步骤如下：

以crRNA为模板进行PCR扩增，得到crRNA序列，所述PCR扩增的引物序列如下：

crRNA-F：

5′-atttctactgttgtagatNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNactagtgcgtcgatatct-3′；

crRNA-R：

5′-agatatcgacgcactagtNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNatctacaacagtagaaat-3′；

其中“N”代表权利要求2所述如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的crRNA；

PCR扩增程序：变性，95℃ 2min；95℃开始每50秒下降0.5℃，降至25℃(140个循环)，最后4℃保温；

PCR体系：Anneaking Buffer for DNA Oligos(5×)20μL，crRNA-F(50μM)20μL，crRNA-R(50μM)20μL，ddH₂O 40μL，总体积100μL；

将质粒载体pQL-2和PCR用SpeI酶单酶切后，经组装酶连接至质粒载体pQL-2的speI酶切位点处，得到重组质粒pQL-spnK-crRNA。