[发明专利]一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用。本发明中是以刺糖多孢菌QL‑1为出发菌株，通过插入crRNA抑制刺糖多孢菌QL‑1的spnK基因表达至失活，构建得到高产多杀菌素J/L的QL‑1/pQL‑spnK‑crRNA基因工程菌。本发明首次在刺糖多孢菌中引入CRISPRi技术，通过CRISPR/ddcpf1方法对spnK基因进行了抑制失活，从而实现了多杀菌素J/L的高水平表达，进而达到了高产多杀菌素J/L的目的。本发明构建的QL‑1/pQL‑spnK‑crRNA工程菌可以稳定传代，并且能够显著提高刺糖多孢菌多杀菌素J/L的产量，是野生刺糖多孢菌的8～9倍。

技术领域

本发明涉及一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

多杀菌素是从刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵液中提取得到的一种大环内酯类生物杀虫剂，具有无公害、高效、低毒、易降解等特点。它对非靶标动物无害，对哺乳动物也无致癌作用。多杀菌素是一种混合物，在该混合物中，多杀菌素A和D是主要组分并且对关键昆虫目标具有最高活性。多杀菌素J和L(多杀菌素混合物中的两种次要组分)是乙基多杀菌素(第二代多杀菌素杀虫剂)的前体。乙基多杀菌素是5,6-二氢-3’-乙氧基多杀菌素J(主要组分)和3’-乙氧基多杀菌素L的混合物(参见说明书附图图1)，其是从多杀菌素J/L进行乙基化和氢化两步化学合成得到的，因此，能够高产多杀菌素J/L的发酵菌株是工业化生产乙基多杀菌素的关键。从多杀菌素生物合成途径分析，将spnK基因失活后，代谢流会发生改变，多杀菌素的发酵菌株将积累更多的多杀菌素J/L，而不是多杀菌素A/D，从而就可以得到大量的合成乙基多杀菌素的前体。

中国专利文献CN103119152A公开了修饰spnK基因以消除其表达的3’-O-甲基转移酶活性的方法，利用基因工程同源重组或是通过诱变或利用RNA干扰技术(RNAi)对spnK基因进行修饰使其失活，从而得到多杀菌素J/L的生产菌株。然而，这几种方法均存在各种缺陷：通过同源重组使spnK失活，需要两步筛选，效率非常低；通过诱变筛选得到spnK的基因突变株，需要更大规模的筛选，而且专一性差；RNAi无法完全抑制基因的转录或翻译，并且容易脱靶导致假阳性或假阴性结果。

CRISPR/Cas是新一代的基因组定点编辑技术，能对活细胞DNA进行精准操作，实现基因片段的特异性插入，删除，替换等，利用CRISPR/Cas技术可以改变基因的序列和功能，控制细胞的命运和生命特征，为遗传性疾病的治疗提供新的方法。CRISPR/Cas系统存在于几乎所有的古菌和大多数细菌中。CRISPR/Cas由一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等)的编码基因和一段CRISPR序列组成，后者由一段前导序列、许多重复序列和间隔序列顺序排列组成。根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究得最为清楚的CRISPR/Cas9为2类Ⅱ型CRISPR系统，2015年张锋小组新发现的CRISPR/Cpf1属于2类Ⅴ型CRISPR系统。其中Ⅱ类系统是目前使用最多且最简单的RNA指导核酸内切酶技术，该系统主要包含两个成分：sgRNA和Cas9，其中sgRNA(single-guide RNA)是由细菌的内源性CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA)融合而成的人工合成RNA，主要发挥引导作用；Cas9由HNH和RuvC两个核酸酶结构域组成，可完成对外源DNA序列的识别和切割。