[发明专利]黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用

说明书

本发明公开黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用。针对现有技术未公开对CGMMV基因间隔区域的注释，也没有构思过从间隔区域筛选目的片段用于抗性烟草培育，本发明提供CGMMV基因间隔区域在介导抗性烟草培育中的应用。本发明筛选出三条CGMMV基因间隔区域片段IR1、IR2、IR3，同时构建嵌合结构IMC，均能成功用于植物干涉载体实现抗性烟草培育。本发明还提供利用这些目的片段介导转基因抗性烟草的完整技术方案。

技术领域

本发明涉及一种植物抗性育种，特别是涉及一种由黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV基因介导的抗性烟草培育技术，属于基因工程、遗传育种领域。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus spp.)。CGMMV能够以西瓜、甜瓜、南瓜、瓠瓜等较多种葫芦科(Cucurbitaceae)植物作为其自然寄主，且是葫芦科植物最主要病毒之一。由于葫芦科是世界范围内仅次于禾本科、豆科与茄科的重要食用植物科，因而黄瓜绿斑驳花叶病毒容易引发田间连续大面积感染与农业生产的规模性损失，已被世界许多国家与地区都列入检疫对象。CGMMV也可侵染苋色藜(Chenopodium Amaranticolor)、曼陀罗(Datura stramonium)、菟丝子(Cuscuta chinensis)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、珊西烟(Nicotianatabacum var Xanthi nc)等。本氏烟是黄瓜绿斑驳花叶病毒的试验寄主，以本氏烟作为研究对象，通过转基因的手段可以更快的解析该病毒的侵染机制。构建本氏烟草抗性材料在CGMMV研究中意义突出。

CGMMV是正义单链RNA病毒，基因组全长6423nt(图1)，5′端有60nt的非编码区，3′端有175nt的非编码区，中间部分有三个编码区。第一个编码区是与病毒复制相关的129KDa和186KDa蛋白，统称为复制相关蛋白。这两个蛋白具有共同的N端。129KDa复制相关蛋白包含甲基转移酶(Vmethyltransforase)与RNA解旋酶(RNA Helicase)结构域以及两者之间的间隔区域(Internal Region，IR)。186KDa复制相关蛋白通读区域对应依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)结构域。第二编码区是运动蛋白MP(MovementProtein)主要介导病毒细胞间运动。第三编码区是外壳蛋白CP(Coat Protein)主要介导病毒长距离运动。

利用病毒基因介导获得转基因植株抗性材料是植物抗性育种重要手段。在CGMMV的该类现有技术中，用以介导植物抗性的病毒基因目标片段均来自于运动蛋白MP与外壳蛋白CP。分别是：将CGMMV的外壳蛋白CP基因构建到植物表达载体，通过农杆菌转化西瓜砧木“gongdae”，获得具有抗性的转基因砧木材料(Transgenic watermelon rootstockresistant to CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus)infection.Plant CellRep(2005)24:350-356)；采用限制性酶切连接的方法将CGMMV的外壳蛋白CP基因构建到载体中，RNA沉默转基因烟草具有抗性(Transgenic Nicotiana benthamiana plantsresistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing.PlantCell Rep(2007)26:1283-1288)；将CGMMV的运动蛋白MP基因正向重复构建到植物表达载体，通过农杆菌转化甜瓜，获得了具有抗性的转基因甜瓜(Molecular analysis oftransgenic melon plants showing virus resistance conferred by direct repeatof movement gene of Cucumber green mottle mosaic virus.Plant Cell Rep(2012)31:1371-1377)。