[发明专利]sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，提供了一种用于特异性靶向IRF7基因的sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该sgRNA引物可与合适的载体结构构成质粒，用于敲除相应的基因实现IRF7功能的缺失。同时，本发明还提供了一种质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用。本发明的细胞系的优势在于：IFN‑βmRNA水平、IRF1mRNA水平、VIPERIN mRNA水平、CMPK2mRNA水平可以达到显著的抑制。相比于CN201910352557.4仅抑制干扰素β表达水平，其其他方面的抑制更为显著。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体而言，涉及一种用于特异性靶向IRF7基因的sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)属于干扰素调节因子(interferon regulatory factor 7,IRF)家族的一员，因能与EB病毒核抗原1(Epsten-Barr virus nuclear antigen-1,EBNA-1)基因Qp启动子上(BamHIQ promoter,Qp)的SRE类似元件结合并抑制其转录而被发现，其现被认为是诱导I型IFN最重要的干扰素调节因子。人的IRF7于1997年首次克隆，是TLR和RIG-I信号通路的共同下游因子。所有的IRF7都含有一个保守的N端DNA结合域(DNA-binding domain,DBD)和一个IRF相关结构域(IRF-associated domain,IAD)，其中IRF家族成员IRF7和IRF3在I型IFN介导的天然免疫中起着关键作用。PRRs对病原体的识别导致IRF3和/或IRF7的激活。磷酸化激活IRF7，诱导核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的二聚化和暴露。激活的IRF7/IRF3转位到细胞核，与激活蛋白1(activating protein 1,AP-1)和核因子κ核因子κtivating protein 1,AP-1)NL形成增强体。这些蛋白结合到它们各自的正调控结构域，导致辅助因子的招募，从而导致I型IFN的转录。

在哺乳动物中，IRF7和IRF3在启动I型干扰素反应以建立抗病毒状态上的协同作用是很有特点的；然而，由于禽类中免疫相关基因的库较少，禽类可能利用不同的调节系统。特别是，禽类缺少IRF3，只有IRF7，它与其哺乳动物同源物的氨基酸序列同源性不到40％。因此，对禽IRF7基因的研究可能是阐明鸭体内宿主免疫调节抗DTMUV的潜在细胞机制的一个很好的起点。

CRISPR/Cas9起源于细菌和古生菌适应性免疫系统，它们防御噬菌体或外来质粒的入侵。CRISPR/Cas9系统可以通过使用Cas9蛋白和gRNA来靶向特定的基因组位点，gRNA包括一个20nt的序列，通过WatsonCrick碱基配对与其DNA靶点结合。靶位点必须有一个序列基序，称为前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)，正好位于20bp的靶序列下游。ZFN和TALEN需要为每个靶序列设计一个新的蛋白质，而CRISPR/Cas9系统中只需将20nt的靶互补gRNA与PAM附近的靶DNA序列进行匹配。因此，这些gRNA可以快速构建并且易于使用。在体外工作显示了特定位点的切割功能之后，迅速开发了CRISPR/Cas9系统。到目前为止，CRISPR/Cas9技术已经应用于人类细胞和许多其他生物，如斑马鱼、小鼠、大鼠，猪和山羊。然而，关于这项技术在鸡中应用的信息很少。

经过检索，得到如下对比文件：CN201910352557.4公开了一种靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用；基于CRISPR/Cas9，设计针对鸡IRF7基因的gRNA靶序列并连接至VK001-02质粒，获得鸡IRF7基因打靶载体；利用脂质体将打靶载体转染至鸡成纤维细胞中。通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞后，经有限倍比稀释法筛选获得敲除chIRF7基因的鸡成纤维细胞。该敲除细胞系经TCID50验证表明其可使病毒滴度增高。