[发明专利]弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因编辑虫株及其应用

权利要求书

1.一种弓形虫基因编辑虫株，其特征在于：该虫株是在野生型Dicre虫株中敲除核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因而获得的。

2.一种构建权利要求1所述弓形虫基因编辑虫株的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，设计TgRPI基因的打靶位点，根据打靶位点设计引物进行定点突变，将上述模板质粒中的sgMIC3替换为TgRPI基因靶点特异的gRNA，构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒；

（2）提取弓形虫RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增TgRPI基因；以pTub::Loxp::GO:: Loxp::YFP::Ter::DHFR*质粒为模板，设计引物扩增含有Tub启动子、YFP荧光报告基因、Ter终止子、乙胺嘧啶药物筛选基因、Cre蛋白识别的Loxp特征性序列的质粒骨架；将TgRPI基因片段和质粒骨架分别回收后进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经氨苄青霉素筛选获得同源重组质粒并进行扩增，得到含有TgRPI-CDS的同源重组模板；

（3）将步骤（1）构建的pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒和步骤（3）扩增得到的同源重组模板共电转至出发虫株，经药物筛选、PCR鉴定获得弓形虫TgRPI基因编辑虫株，

所述TgRPI基因的打靶位点序列如SEQ ID No.7所示；

所述pSAG1-Cas9-TgU6-sgTgRPI质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述Loxp特征性序列如SEQ ID No.4所示；

所述同源重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述同源重组质粒的扩增引物是：

Dicre-TgRPI-5H-F：SEQ ID No.5；

Dicre-TgRPI-3H-R：SEQ ID No.6。

3.权利要求1所述的弓形虫基因编辑虫株在制备弓形虫疫苗中的应用，所述弓形虫基因编辑虫株的体外生长和体内繁殖能力下降，是一种毒力致弱株，且该虫株对动物具有良好免疫保护力。