[发明专利]弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因编辑虫株及其应用

说明书

弓形虫核酮糖‑5‑磷酸异构酶TgRPI基因编辑虫株及其应用。本发明公开了一个有潜力的疫苗和药物设计靶点和一种预防弓形虫感染的基因敲除虫株。所述疫苗和药物设计靶点为弓形虫核酮糖‑5‑磷酸异构酶TgRPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述基因敲除虫株敲除了TgRPI基因，该基因敲除虫株在体外生长速度减缓，但是可以传代培养，在动物体内具有毒力小、繁殖少等特性，能提高动物对弓形虫的免疫能力。由于TgRPI对弓形虫体内外生长有重要作用，故有成为疫苗和药物靶点的潜力，且该基因敲除虫株有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种预防弓形虫感染的基因缺失疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

弓形虫是从属于顶复门的一种专性细胞内寄生原虫，能够感染包括人在内的几乎所有温血动物，入侵所有的有核细胞，是非常重要的人畜共患病原体。弓形虫感染孕妇或者孕畜可导致流产、产死胎或畸形胎等；感染艾滋病和器官移植患者等免疫力低下或受损的人群可导致急性呼吸衰竭、局限性肺炎、视网膜脉络丛炎等，严重时可以致死。尽管弓形虫病防治需求迫切，但是目前尚无理想的药物或者疫苗，因此，筛选潜在的疫苗和药物设计靶点、研制候选的弓形虫疫苗显得至关重要。

高温灭活弓形虫速殖子或提取弓形虫可溶性、分泌性天然蛋白，免疫接种动物，不能引起免疫保护或者免疫保护效果非常有限。构建重组蛋白或基于载体的亚单位疫苗，虽能在一定程度延长动物的存活时间，但是仍不能提供足够的免疫保护力，保护效果不理想。

构建良好的减毒或弱毒活疫苗被认为是预防弓形虫病最有希望的策略。当前市场上唯一的商品化弓形虫疫苗是通过在实验室传统传代致弱获得的，其仅在绵羊中使用且存在毒力返强的风险，并不适用于我国畜牧养殖业。尽管利用遗传学的手段进行了弓形虫减毒虫株的构建，但是，目前具备潜力的弓形虫减毒候选活疫苗数量仍非常有限，仍需筛选更多潜在的疫苗设计靶点，研制更多候选的弓形虫疫苗虫株。

虫体中重要的代谢途径可以成为潜在的药物和疫苗设计靶点。磷酸戊糖途径(PPP)是葡萄糖代谢的重要途径，产生核酮糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸(F6P)、核糖-5-磷酸(R5P)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)等中间产物，与糖酵解、氨基酸和脂肪酸等代谢途径形成碳代谢网络。弓形虫PPP途径非氧化反应阶段核酮糖-5-磷酸异构酶(TgRPI)催化核酮糖-5-磷酸(Ru5P)生成核糖-5-磷酸(R5P)，而R5P是核苷酸代谢的重要底物。本发明聚焦TgRPI在弓形虫体外生长、体内繁殖与毒力的作用。我们利用CRISPR/Cas9遗传改造技术构建了TgRPI敲除虫株，该虫株在体外可以传代培养，但是缺失TgRPI基因减缓虫体体外生长，并显著降低体内繁殖，降低体内毒力，表明：弓形虫TgRPI是一个有潜力的疫苗和药物设计靶点。TgRPI敲除虫株具有良好免疫原性和免疫保护力，其是减毒弓形虫候选疫苗虫株，其应用对于人类健康和畜牧养殖业的健康发展均具有重要价值和意义。

发明内容

针对弓形虫病目前尚无理想的药物或者疫苗，本发明的目的在于提供一种弓形虫基因编辑虫株及其构建方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种弓形虫基因编辑虫株，该虫株缺失核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的弓形虫核酮糖-5-磷酸异构酶TgRPI基因，接着分析了敲除虫株的特性，并研究了敲除虫株的应用，具体内容如下：

(1)空斑实验结果表明：缺失TgRPI基因减缓虫体体外生长。

(2)荷虫量实验结果表明：缺失TgRPI基因显著降低体内繁殖。

(3)毒力试验结果表明：敲除TgRPI基因显著降低虫体对小鼠的毒力。

(4)免疫保护力试验结果表明：免疫接种TgRPI基因敲除虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。

本发明进一步提供了一种所述弓形虫基因编辑虫株的构建方法，该方法包括以下步骤：