[发明专利]生产尿嘧啶糖基化酶的方法及用于该方法的双载体系统

权利要求书

1.一种生产尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供一种表达细胞，所述表达细胞包含能够表达所述UDG的第一载体和能够表达分子伴侣素系统GroEL-GroES的第二载体，其中，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且所述GroEL和GroES的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

b)在第一诱导条件下诱导所述表达细胞表达所述分子伴侣素系统GroEL-GroES；

c)在第二诱导条件下诱导所述表达细胞同时表达所述分子伴侣素系统GroEL-GroES和所述UDG。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一诱导条件为使用第一诱导剂(例如阿拉伯糖)于16℃至37℃诱导5小时至0.5小时，优选于25℃诱导3小时，以诱导所述表达细胞表达所述分子伴侣素系统GroEL-GroES；所述第二诱导条件为使用所述第二诱导剂(例如阿拉伯糖)和第三诱导剂(例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))于16℃至20℃、优选于16℃诱导16小时至20小时，以诱导所述表达细胞同时表达所述分子伴侣素系统GroEL-GroES和所述UDG，其中所述第二诱导剂诱导所述表达细胞表达所述分子伴侣素系统GroEL-GroES，所述第三诱导剂诱导所述表达细胞表达所述UDG。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一诱导剂和所述第二诱导剂的浓度各自独立地为0.001％至1.0％，优选为0.4％；所述第三诱导剂的终浓度为0.1mM至1.0mM，优选为0.1mM。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，所述表达细胞是通过分别用所述第一载体和第二载体转化同一宿主细胞获得的；

优选地，所述第一载体和所述第二载体是通过不同转化方法来转化所述宿主细胞的，所述转化方法为例如热激法和/或电击法；更优选地，所述第一载体是通过热激法来转化所述宿主细胞的，所述第二载体是通过电击法来转化所述宿主细胞的。

优选地，所述第一载体和所述第二载体为质粒；更优选地，所述第一载体为表达所述UDG的质粒，例如pET21a、pHUE、pET20b、pET-22b、pET-28a、或pET-32a质粒，优选为pET21a质粒；所述第二载体为表达所述分子伴侣素系统GroEL-GroES的质粒，例如pBAD33质粒；

优选地，所述宿主细胞为原核细胞，例如细菌细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括步骤d)：破碎在步骤c)中得到的表达细胞，并通过亲和层析在4℃至10℃的温度下纯化所述UDG；

优选地，所述第一载体还表达亲和标签，例如His标签、FLAG标签、HAT标签、HPC标签、MBP标签、NusA标签、UB标签、或GST标签，优选6×His标签，并且所述亲和层析利用所述亲和标签来进行。

6.一种双载体系统，所述双载体系统包含：

(1)第一载体，所述第一载体能够表达尿嘧啶糖基化酶(UDG)，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及

(2)第二载体，所述第二载体能够表达分子伴侣素系统GroEL-GroES，所述GroEL和GroES的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

7.根据权利要求6所述的双载体系统，其中，所述第一载体和所述第二载体为质粒，优选地，所述第一载体为表达所述UDG的质粒，例如pET21a、pHUE、pET20b、pET-22b、pET-28a、或pET-32a质粒，优选为pET21a质粒；所述第二载体为表达所述分子伴侣素系统GroEL-GroES的质粒，例如pBAD33质粒。

8.根据权利要求6或7所述的双载体系统，其中，所述第一载体还表达亲和标签，例如His标签、FLAG标签、HAT标签、HPC标签、MBP标签、NusA标签、UB标签、或GST标签，优选6×His标签。