[发明专利]应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、设计可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA；

步骤2、构建蛋白质核酸复合物；

将重组蛋白Cas9与可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA组装为蛋白质核酸复合物；

步骤3、构建含有GFP₁₁序列的单链DNA序列；

在GFP₁₁序列的左右两端分别添加一段碱基序列，该段碱基序列与LGR5部分序列同源；

步骤4、构建稳定表达GFP_1-10的胶质瘤干细胞GSCs；

步骤5、利用共转染技术将步骤2构建的蛋白质核酸复合物与步骤3构建的含有GFP₁₁的单链DNA序列共同转入到步骤4构建的稳定表达GFP_1-10的胶质瘤干细胞GSCs中，GFP_1-10蛋白和GFP₁₁蛋白整合成一个完整的，具有发光功能的绿色荧光蛋白，实现胶质瘤干细胞中内源LGR5蛋白标记。

2.根据权利要求1所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于：

步骤1中可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA通过下述步骤获得：

步骤1.1、合成含有LGR5靶点的引物；

步骤1.2、通过sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen)，采用T7 RNA聚合酶复合物在体外转录sgRNA。

3.根据权利要求2所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于，步骤1中可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA序列为：

LGR5 C端(2000-2724bp)：TGAGAAAGCAAACCTACGTCTGG；

LGR5第一个环(500-1020bp)：ATGAATTCCCCACTGCAATTAGG；

LGR5两环之间(1081-1680bp)：GAAAGATGCTGGAATGTTTCAGG。