[发明专利]应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒

说明书

本发明属于胶质瘤技术，具体涉及一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒，克服因缺乏高特异性的抗体，使得现有方法无法准确检测LGR5在GSCs中的内源蛋白表达水平的难题。本发明巧妙的应用CRISPR/Cas9技术用较小的亚基GFPsubgt;11/subgt;标记LGR5蛋白，同时构建稳定表达较大亚基GFPsubgt;1‑10/subgt;蛋白的GSCs。当两个片段在同一细胞内，这两个部分能够稳定地相互作用，产生具有发光功能的GFP，从而可检测胶质瘤干细胞中的LGR5内源表达水平。其检测方法稳定性好，便于推广。

技术领域

本发明属于胶质瘤技术，具体涉及一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒。

背景技术

胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme，GBM)是成人中枢神经系统最常见且恶性程度最高的脑肿瘤。由于恶性胶质母细胞瘤呈现高度侵袭生长，肿瘤与正常脑组织边界不清，致使外科手术很难做到完全切除。尽管以放疗及化疗为主的临床治疗技术有了提高和改善，但胶质母细胞瘤患者的复发仍不可避免，中位生存期仅为15个月，确诊后的五年生存率小于5％。因此，对于高度异质性的胶质母细胞瘤，发现有效的治疗靶点并开发出新的治疗方法具有十分重要的研究意义。

胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cells,GSCs)是GBM组织中存在的一个细胞亚群，它占肿瘤细胞的比例较小，具有自我更新、多系分化潜能、促血管生成和促细胞迁移侵袭等作用，在诱发胶质瘤发生、发展及复发过程中起关键作用。GSCs对临床一线化疗药物替莫唑胺耐受，可通过调节DNA损伤修复，激活Notch、NF-κB、EZH2等信号通路抵抗放疗与化疗，被认为是胶质瘤治疗的趋势和焦点。

通过分析60个人源GSCs以及366个GBM患者组织样品的转录组发现，LGR5在IDH野生型的GSCs/GBMs中异常高表达。通过siRNA/shRNA介导的LGR5沉默可抑制GSCs的自我更新及迁移能力。研究表明LGR5是胶质瘤治疗的潜在靶点，明确参与调控GSCs自我更新的LGR5下游信号通路，并对其进行干扰阻断，从而达到治疗效果。然而由于缺乏高特异性的抗体，LGR5在GSCs中的内源蛋白表达水平仍不能准确检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及其用途，融合最新的内源蛋白标记技术，即CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术，在胶质瘤干细胞中标记内源LGR5蛋白，克服因缺乏高特异性的抗体，使得现有方法无法准确检测LGR5在GSCs中的内源蛋白表达水平的难题。

本发明的技术方案是：

一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

步骤1、设计可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA；

步骤2、构建蛋白质核酸复合物；

将重组蛋白Cas9与可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA组装为蛋白质核酸复合物；

步骤3、构建含有GFP₁₁序列的单链DNA序列；

在GFP₁₁序列的左右两端分别添加一段碱基序列，该碱基序列与LGR5部分序列同源；

步骤4、构建稳定表达GFP_1-10的胶质瘤干细胞GSCs；