[发明专利]一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法

说明书

本发明提供一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，可以进行精确地基因定点突变；由sgRNA和同源重组片段建立基因编辑系统，可精确地将卡氏住白细胞虫的R7蛋白和荧光标签蛋白等目的片段同源重组于ETH_00009555基因，构建一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体。所述重组球虫载体DNA经过PCR检测和测序，表明R7基因和荧光标签基因已成功重组于ETH_00009555基因；且重组球虫载体在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功表达R7蛋白和荧光标签蛋白。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。

背景技术

CRISPR-Cas9基因编辑系统是由规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein9，Cas9)组成，是继锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectornucleases，TALENs)技术之后迅速发展起来的基因组编辑技术，在细胞基因敲除中已被广泛应用。CRISPR-Cas9通过小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)识别靶序列并引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，使DNA发生双链断裂(DNA double-strand break，DSB)。断裂的DNA为防止被降解会自动启动内源性修复机制，而内源修复机制通常有两种，在非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)修复机制下修复时，在断裂缺口处往往随机的插入或删除碱基，若突变位点位于蛋白编码区(coding sequence，CDS)，将转录错误mRNA，导致翻译失败或蛋白失活从而实现基因敲除，而在同源重组(Homologous recombination，HR)修复机制以及修复模板存在的条件下，可以实现定点单个碱基或长片段的插入、删除或者突变，形成基因的重组与敲除。

鸡卡氏住白细胞虫病是由卡氏住白细胞虫侵害鸡的血液和内脏器官的组织细胞而引起的一种原虫病，这种原虫病对雏鸡(0～50天为雏鸡)的危害极大。鸡卡氏住白细胞虫寄生于鸡的红细胞、白细胞和内脏组织细胞内，引起鸡患血孢子虫病，主要临床表现为鸡冠发白、消瘦或绿色稀粪，成年鸡感染率高，鸡感染卡氏住白细胞虫后其生长发育受阻。

鸡球虫病是常见且危害十分严重的寄生虫病，对养鸡行业造成了严重的影响。柔嫩艾美耳球虫是众多球虫中的一种，其致病力最强，寄生于鸡的盲肠，主要危害3月龄内的雏鸡，鸡在食用球虫卵囊后，球虫在肠道内着床，繁殖并损害组织。病鸡感染球虫病后发病突然，容易造成大规模感染，对养殖厂造成巨大的损失。

卡氏住白细胞虫病和鸡球虫病是规模化养鸡工厂所面临的重要挑战，传统的药物治疗方法长期使用会产生耐药性和药物残留等问题，目前大量的实验表明虫体对多数抗虫药物已经产生了抗药性，因此开发针对球虫病和卡氏住白细胞虫病的疫苗是防治的关键。

目前利用基因工程技术研制的卡氏住白细胞虫病疫苗主要有重组亚单位疫苗和转基因植物疫苗两种。单一的疫苗只能对应一种球虫病，要想实现多种球虫病的免疫，需要较长的时间建立免疫屏障。在大型养殖孵化场中，快速免疫保护、降低鸡群的发病风险具有至关重要的作用，但是目前还没有能够同时免疫卡氏住白细胞虫和柔嫩艾美耳球虫的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法，利用所述CRISPR-Cas9基因编辑系统可以在ETH_00009555基因上插入R7基因和EGFP基因，构建的重组球虫能稳定高效表达荧光信号和R7蛋白。本发明成功构建了表达R7蛋白和荧光蛋白标签的球虫载体，所述球虫载体便于筛选，其在荧光显微镜下能观察到自发荧光，且在靶向R7基因和荧光蛋白基因的PCR检测下为阳性。