[发明专利]一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法、细胞株的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：

(1)构建基于荧光素酶报告基因细胞株；

(2)待测样品配置成溶液后加入到培养液中，然后将培养液加入到含有细胞株的培养基中，吸进培养液后，测定荧光素酶活性来检测细胞毒性。

2.一种根据权利要求1所述的基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：

S1：构建fthl29-pGL6-TA质粒：

S1.1：启动子合成：获得fthl29基因启动子片段；

S1.2：连接转化：首先将pGL6-TA载体用KpnI和XhoI酶切，然后将酶切后的pGL6-TA载体与fthl29基因启动子片段进行酶连，酶连结束后转化到大肠杆菌感受态细胞中；

S1.3：筛选验证：将转化后的大肠杆菌涂布在含有抗生素的平板上，倒置培养12-16h，挑菌进行PCR鉴定，对阳性菌落提取质粒，酶切鉴定重组质粒，将阳性克隆进行测序，测序比对成功后，抽提质粒，获得构建好的重组表达质粒fthl29-pGL6-TA；

S2：fthl29-pGL6-TA质粒转染细胞：

S2.1：HepG2细胞复苏与培养：冻存的HepG2细胞先在40℃水浴中溶解，溶解后转入37℃水浴中进行复苏，复苏后800r/min离心5min，吸去上清，加入优化的DMEM培养液，置于培养箱中培养；

S2.2：细胞转染：铺板HepG2细胞，培养12h后加入到转染体系中37℃培养48h，弃去转染液，加入培养液，待细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞汇合度为30％，进行阳性单克隆筛选，得到转染细胞；

S3：筛选稳定细胞系：

S3.1：G418筛选：将上述转染细胞用PBS洗涤，胰蛋白酶消化，接种到培养皿中，然后加入含G418的培养基，2-3天更换一次筛选培养基，当细胞汇合度在90％以上时将细胞转移至培养瓶中继续培养，加入含G418的培养基，转染的细胞长到70％以上，挑取单克隆细胞继续培养，加入含G418的培养基，此时G418浓度降一半；

S3.2：挑取单克隆与扩大培养：采用有限稀释法筛选阳性克隆，得到细胞株。

3.根据权利要求2所述的一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，其特征在于：在步骤S1.1中，从NCBI上获取斑马鱼fthl29基因的转录起始位点上游3kb的碱基序列，为启动子片段。

4.根据权利要求2所述的一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，其特征在于：在步骤S1.2中，所述大肠杆菌感受态细胞采用TOP10感受态细胞。

5.根据权利要求2所述的一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，其特征在于：在步骤S1.3中，所述抗生素为氨苄青霉素。

6.根据权利要求2所述的一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，其特征在于：在步骤S2.1中，所述优化的DMEM培养液为含10％胎牛血清和1％青链霉素双抗生素的DMEM培养液，所述培养箱中的培养条件为5％CO₂和37℃。

7.根据权利要求2所述的一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，其特征在于：在步骤S2.2中，所述转染体系包括2.5μg fthl29-pGL6-TA质粒、1.25μg pSV-β-galactosidase内对照质粒、5μL P3000^TM试剂、3.75μL Lipofectamine 3000试剂和250μLDMEM培养基。

8.根据权利要求2所述的一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，其特征在于：在步骤S3.2中，所述有限稀释法筛选阳性克隆的步骤为：制备细胞悬液，细胞计数，培养液稀释细胞到1个/10μL，在96孔板中加入含G418的培养基150μL/孔，G418浓度为250μg/mL，再加入细胞悬液10μL/孔，在显微镜下挑取阳性克隆，转入到新孔中培养，重复筛选，待培养的细胞基本不再死亡时，PCR鉴定，得到细胞株。