[发明专利]一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法、细胞株的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法，包括：(1)构建基于荧光素酶报告基因细胞株；(2)待测样品配置成溶液后加入到培养液中，然后将培养液加入到含有细胞株的培养基中，吸进培养液后，测定荧光素酶活性来检测细胞毒性。细胞株的构建方法，包括：S1：构建fthl29‑pGL6‑TA质粒；S2：fthl29‑pGL6‑TA质粒转染细胞；S3：筛选稳定细胞系。该细胞株在表征污染物毒性、实际水样综合毒性方面的应用。本发明以铁死亡相关基因启动子构建的报告基因细胞株能快速指示早期的细胞毒性，其特异性高、敏感性高，且便于高通量检测；且既适用于大多数毒害污染物的毒性效应检测，表征铁死亡相关细胞毒性，也能用于复杂实际水样的毒性表征。

技术领域

本发明属于污染物细胞毒性检测技术领域，具体涉及一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法、细胞株的构建方法及其应用。

背景技术

据不完全统计，世界上已登记的化学物质达2.5亿种，销售、生产、使用的化学物质约13-14万种，经常使用的约4000多种，而且每年以2万种的速度增加。化学药物和实际、食品添加剂、农药、建筑装饰材料、化妆品等化学品频繁出现在人们的生产生活中，这些化学品对人类健康和生物的影响受到密切关注。当人们日常生活中所产生的各种化学物质直接或间接地进入水体，超过水体负载而造成水污染，会影响水生物或间接影响人体健康。然而，指示水污染的传统水质指标如COD、BOD₅、总氮和总磷等无法指示水体的毒性效应；发光菌试验、Ames试验、微核试验、彗星试验等传统毒性检测方法以及体内毒性试验虽能够检测水体毒性，但耗时费力。基于荧光素酶报告基因的毒性检测技术以简便快速、灵敏度高和重复性好等优点备受青睐。

许多环境污染物通过诱发细胞死亡导致严重的毒性效应。传统的细胞死亡方式包括凋亡、坏死及自噬等。铁死亡是近年来新发现的一种铁依赖性、非凋亡形式的细胞程序性死亡方式。铁代谢异常和脂质过氧化是铁死亡的两大重要环节，其过程伴随能量代谢紊乱、炎症、氧化应激上调以及细胞内重要细胞器的功能损害。最新研究表明铁死亡是污染物的常见毒性效应之一。因此，构建可以指示早期铁死亡相关细胞毒性效应的报告基因细胞株，可以更加灵敏地检测污染物和实际水体的早期细胞毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法、细胞株的构建方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法，按照先后顺序包括以下步骤：

(1)构建基于荧光素酶报告基因细胞株；

(2)待测样品配置成溶液后加入到培养液中，然后将培养液加入到含有细胞株的培养基中，吸进培养液后，测定荧光素酶活性来检测细胞毒性。

一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，按照先后顺序包括以下步骤：

S1：构建fthl29-pGL6-TA质粒：

S1.1：启动子合成：获得fthl29基因启动子片段；

S1.2：连接转化：首先将pGL6-TA载体用KpnI和XhoI酶切，然后将酶切后的pGL6-TA载体与fthl29基因启动子片段进行酶连，酶连结束后转化到大肠杆菌感受态细胞中；

S1.3：筛选验证：将转化后的大肠杆菌涂布在含有抗生素的平板上，倒置培养12-16h，挑菌进行PCR鉴定，对阳性菌落提取质粒，酶切鉴定重组质粒，将阳性克隆进行测序，测序比对成功后，抽提质粒，获得构建好的重组表达质粒fthl29-pGL6-TA；

S2：fthl29-pGL6-TA质粒转染细胞：