[发明专利]一种利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法

权利要求书

1.一种利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、收集中华鳖胚胎，挑选良好的受精的胚胎，将挑选的胚胎放置在经过消毒的黄沙中，孵化至第15.5期时，用微量注射器向胚胎注射3-5μL诱导剂，诱导剂的有效成分为特异性激动剂1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1H-吡唑，诱导剂的特异性激动剂浓度为2μg/μL；

S2、注射诱导剂后，按照与步骤S1相同的孵化条件孵化至稚鳖出壳；

S3、在胚胎发育至27期时，收集性腺，进行组织学分析，鉴定中华鳖为生理性雌性或雄性，统计性别比例；

S4、对中华鳖的ZZ或ZW基因型进行鉴定，分析ZZ伪雌鳖的数量及比例。

2.根据权利要求1所述的利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，所述步骤S1中，诱导剂的制备方法为将特异性激动剂溶于92％-98％的酒精或二甲基亚砜溶剂中。

3.根据权利要求2所述的利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，所述步骤S1中，诱导剂的制备方法具体包括以步骤，取20μL体积的浓度为100mg/mL的DMSO诱导剂母液加到400μL的PEG300中，混合均匀后加入50μL Tween-80，混合均匀，继续加入530μL生理盐水定容至1mL得到诱导剂，诱导剂中DMSO的含量为2％。

4.根据权利要求1所述的利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，所述步骤S1包括通过手电筒照射确定胚胎气室的位置，使气室朝上，用医用酒精消毒后，在气室上方的卵壳上用不锈钢注射器针头刺破卵壳，用微量注射器向胚胎的气室中注射诱导剂，之后用组织胶水粘合注射位置，并使气室的位置朝上，摆放于黄沙中继续孵化。

5.根据权利要求1-4任一所述的利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，所述步骤S1中，孵化条件为温度25-33℃，空气相对湿度70％-90％。

6.根据权利要求1所述的利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用组织学切片HE染色法进行生理性性别鉴定，采用雌性相关基因Foxl2、雄性相关基因Sox9的免疫荧光染色法进行生理性性别鉴定。

7.根据权利要求1所述的利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，所述步骤S4中，采用PCR法鉴定基因型。

8.根据权利要求7所述的利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法，其特征在于，所述步骤S4中，所用上游引物的序列为5’-GATCGAATTACATCCTGCCT-3’，下游引物的序列为5’-TAAATTAGGACTGGAAGACACC-3’。