[发明专利]一种试剂盒及其制备测序用靶核苷酸的方法

权利要求书

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含第一接头序列、第二接头序列、短寡核苷酸序列；

所述第一接头序列的5’末端被腺苷酸化，所述第一接头序列的3’末端修饰有间隔子；

从5’端到3’端，所述第一接头序列包含反义接头互补区、第一引物结合区；

从5’端到3’端，所述第二接头序列包含第二引物结合区以及可与所述反义接头互补区反向互补配对的正义接头互补区；

所述短寡核苷酸序列可与所述第一接头序列上靠近5’末端的部分序列反向互补配对。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反义接头互补区含有反义分子标签序列；

所述反义分子标签序列位于所述第一接头序列的5’末端；

所述短寡核苷酸序列的3’末端修饰有阻断基团，用于阻止该末端延伸；

所述短寡核苷酸序列的3’末端修饰有双脱氧核苷酸残基。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述短寡核苷酸序列的长度为9～11nt，优选为9～10nt，该长度不包含3’末端修饰的双脱氧核苷酸残基；

所述反义分子标签序列的长度为5～7nt，优选为5～6nt，更优选为5nt；

所述反义分子标签序列为随机序列。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一接头序列包含如下核苷酸序列：

5'-/rAPP/NNNNNAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAA/Spacer C3/-3'；

所述第二接头序列包含如下核苷酸序列：

5'-GGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNN-3'；

所述短寡核苷酸序列包含如下核苷酸序列：

5'-GACTTNNNN/ddN/-3'；

“/rAPP/”表示预腺苷酸化修饰，“Spacer C3”表示Spacer C3修饰，“/ddN/”表示2’,3’-双脱氧修饰的核苷酸，“N表示”A、T、G、C四种碱基中的任一种碱基，第一接头序列中的“NNNNN”表示反义分子标签，第二接头序列中的“NNNNN”表示正义分子标签，所述正义分子标签与所述反义分子标签反向互补。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一接头序列包含SEQ ID No.1～17所示序列中的至少一种；

所述第二接头序列包含SEQ ID No.18～34所示序列中的至少一种；

所述短寡核苷酸序列包含SEQ ID No.35～51所示序列中的至少一种。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一接头序列包含如下核苷酸序列：

5'-/rAPP/GTCTAAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAA/Spacer C3/-3'；

/rAPP/表示预腺苷酸化修饰，Spacer C3表示Spacer C3修饰；

所述第二接头序列包含如下核苷酸序列：

5'-GGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTAGAC-3'；

所述短寡核苷酸序列包含如下核苷酸序列中的至少一种：

5'-CCGACTTTAGA/ddC/-3'；

5'-CGACTTTAGA/ddC/-3'；

5'-GACTTTAGA/ddC/-3'；

/ddC/表示2',3'-双脱氧修饰的胞嘧啶核苷酸。

7.一种使用权利要求1～6任意一项所述试剂盒制备测序用靶核苷酸的方法，其特征在于，包括：

退火步骤，包括用连接酶将所述第一接头序列与所述短寡核苷酸序列退火，形成含双链结构的退火产物；

第一连接步骤，包括将所述退火产物连接至靶核苷酸，得到第一连接产物；

第二连接步骤，包括向第一连接产物所在的反应体系中加入所述第二接头序列，通过竞争性链置换作用，使得所述第一连接产物上的短寡核苷酸序列被第二接头序列置换，得到连接有所述第二接头序列的第二连接产物，即为所述测序用靶核苷酸。