[发明专利]一种试剂盒及其制备测序用靶核苷酸的方法

说明书

一种试剂盒及其制备测序用靶核苷酸的方法，试剂盒包含第一接头序列、第二接头序列、短寡核苷酸序列，第一接头序列的5’末端被腺苷酸化，所述第一接头序列的3’末端修饰有间隔子；从5’端到3’端，所述第一接头序列包含反义接头互补区、第一引物结合区；从5’端到3’端，所述第二接头序列包含第二引物结合区以及可与所述反义接头互补区反向互补配对的正义接头互补区；所述短寡核苷酸序列可与所述第一接头序列上靠近5’末端的部分序列反向互补配对。本发明提供了特殊设计的接头序列以及对接头的修饰，无接头二聚体产生，且降低了样本DNA片段的嵌合体形成。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种试剂盒及其制备测序用靶核苷酸的方法。

背景技术

第二代测序(NGS)已经发展成为分子生物学中一种非常强大的工具，使得基因组鉴定、基因检测、药物发现和疾病诊断等领域取得了快速进展。随着第二代测序(NGS)技术的不断进步，单次测序的核酸的数量正在增加。这使得研究人员能够对更大量的样本进行测序，并且每个样本的reads数得到提升，从而能够检测该样本中的微小序列变化。第二代测序技术(NGS)通过检测出患者体内存在的罕见等位基因或者突变，在肿瘤检测领域，有着极其广泛的应用。但是在基于现有的国产化测序平台所使用的AT连接建库方式对于低频突变的检出，灵敏度较低。建库过程中容易造成含有罕见突变的拷贝丢失。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一接头序列、第二接头序列、短寡核苷酸序列；

所述第一接头序列的5’末端被腺苷酸化，所述第一接头序列的3’末端修饰有间隔子(Sp acer)；3’末端的间隔子可以阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用，在反应中作为阻断基团；

从5’端到3’端，所述第一接头序列包含反义接头互补区、第一引物(index1)结合区；

从5’端到3’端，所述第二接头序列包含第二引物结合区以及可与所述反义接头互补区反向互补配对的正义接头互补区；

所述短寡核苷酸序列可与所述第一接头序列上靠近5’末端的部分序列反向互补配对。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种使用第一方面所述试剂盒制备测序用靶核苷酸的方法，包括：

第一连接步骤，包括用连接酶将所述第一接头序列与所述短寡核苷酸序列退火，形成含双链结构的第一连接产物；

第二连接步骤，包括将所述第一连接产物连接至靶核苷酸，得到第二连接产物；

第三连接步骤，包括向第二连接产物所在的反应体系中加入所述第二接头序列，通过竞争性链置换作用，使得所述第二连接产物上的短寡核苷酸序列被第二接头序列置换，得到连接有所述第二接头序列的第三连接产物，即为所述测序用靶核苷酸。

依据上述实施例的一种试剂盒及其制备测序用靶核苷酸的方法，本发明提供了特殊设计的接头序列以及对所述接头的修饰，无接头二聚体产生，且降低了样本DNA片段的嵌合体形成。

附图说明

图1为一种实施例的的测序接头结构示意图。

图2为一种实施例的含双链结构的Adapter1和短oligo退火产物结构示意图。

图3为实施例1的质控结果图。

图4为实施例2的质控结果图。

图5为实施例3的测序深度结果图。

图6为25ng起始量下分别用CN110248675A专利中的接头(Adapter)和本发明实施例1中的接头(Adapter)进行实验的测序结果有效深度。

具体实施方式