[发明专利]基于CRISPR的多色、正交、高灵敏度的RNA成像方法

权利要求书

1.一种sgRNA-适配子，其特征在于：包括Cas13 sgRNA和插入在Cas13 sgRNA的茎环结构中的具有重复结构的适配子；所述的Cas13 sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的sgRNA-适配子的设计为：将Cas13 sgRNA的茎环结构5’-AGUU|UUGA-3’拆分后，插入互补配对支架序列连接适配子的发卡结构；具有重复结构的适配子的重复结构之间插入互补配对支架序列使多个适配子折叠形成正确结构。

2.根据权利要求1所述的sgRNA-适配子，其特征在于：所述的适配子为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、3所示的Broccoli、Pepper，具有重复结构的适配子包括2xBroccoli、2xPepper、8xPepper。

3.根据权利要求1所述的sgRNA-适配子，其特征在于：所述的适配子为Broccoli或Pepper时，具有重复结构的适配子的重复结构之间插入互补配对支架序列为5’-UCU|AGA-3’或5’-CUC|GAG-3’。

4.根据权利要求1-3任一项所述的sgRNA-适配子，其特征在于：所述的sgRNA-适配子的5’端还连接有含靶向RNA的spacer序列。

5.一种重组质粒，其特征在于：包含权利要求1-4任一项所述的sgRNA-适配子序列。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：包含权利要求4所述的sgRNA-适配子序列。

7.权利要求1-4任一项所述的sgRNA-适配子或权利要求5或6所述的重组质粒在RNA成像中的应用。

8.一种使用sgRNA-适配子进行RNA成像的方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求6所述的重组质粒和dPspCas13b蛋白表达载体转染到靶细胞中，孵育后除去培养基，用小分子荧光团染色，使用显微镜拍摄成像。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于：使用的sgRNA-适配子为sgRNA-多色适配子或多个插入不同适配子的sgRNA-适配子时，能实现相同或不同靶标RNA的多色成像或正交多色成像，实现RNA相互作用的可视化；sgRNA-多色适配子为在sgRNA中插入多个不同的适配子。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于：通过小分子荧光团的洗脱和再染色实现靶标RNA的实时成像颜色转换。