[发明专利]基于CRISPR的多色、正交、高灵敏度的RNA成像方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR的多色、正交、高灵敏度的RNA成像方法，属于RNA成像技术领域。本发明基于Cas13 sgRNA和适配子，设计了插入具有重复结构适配子的sgRNA‑适配子，利用其与的dCas13b的结合，建立了一种多色、高效、正交的RNA成像方法。本发明的设计提高了sgRNA‑适配子的稳定性，并在不影响靶向性的前提下提高信噪比，实现低丰度RNA的成像和RNA相互作用的可视化。本发明具有普适性，可针对不同靶标RNA设计spacer序列进行荧光成像；本发明在进行多靶标多色成像时，只需一种dCas13b蛋白和几种sgRNA‑适配子，减少了蛋白设计成本和相关的实验操作。

技术领域

本发明属于RNA成像技术领域，具体涉及基于CRISPR的多色、正交、高灵敏度的RNA成像方法。

背景技术

RNA在细胞内的时空定位与其生物学功能密切相关，因此需要通过活细胞中的成像方法来揭示RNA的动力学。MS2-MCP系统和分子标签常用于可视化RNA，然而它们很难追踪活细胞中的RNA相互作用。RNA适配体的成像技术大大降低了背景荧光，且能设计一系列小分子荧光团，提供从青色到红色的广泛的发射波长选择，然而尽管该方法能够进行mRNA成像，但它需要外源地插入数十个发夹RNA，这将不可避免地影响靶标RNA的结构和功能，使得这个系统在研究内源性RNA的行为时存在障碍。

规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPRs)技术主要应用于基因编辑和调控。最近，基于CRISPR/Cas的方法，包括靶向RNA的CRISPR-dCas9，已经被研究用来追踪高丰度的mRNA的整体运动，如β-肌动蛋白到应激颗粒，但尚不清楚是否有可能可视化其他较低丰度的RNA或单个转录本。几种多色CRISPR-dCas9成像系统也已经被开发出来，虽然这些系统有较高的基因组标记效率，但目前尚不清楚这些系统是否能标记RNA。先前研究证实，CRISPR-dCas13能够定位包含重复序列的RNA和成像，然而，只有荧光蛋白标记了的dLwaCas13a和dPspCas13b已被用于成像。基于dLwaCas13a的方法仅被用于标记细胞应激条件下的高丰度mRNA，是否也可以其他低丰度的RNA尚不清楚。同时，基于dPspCas13b-3xEGFP的方法具有较高背景，导致在没有足够序列数量的情况下无法进行RNA成像。

发明内容

本发明的目的在于提供一种sgRNA(单链向导RNA)-适配子，以及所述sgRNA-适配子在RNA成像中的应用，和基于所述sgRNA-适配子的RNA成像方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种sgRNA-适配子，包括Cas13 sgRNA和插入在Cas13 sgRNA的茎环结构中的具有重复结构的适配子。所述的适配子优选为Broccoli或Pepper，具有重复结构的适配子可以为2xBroccoli、2xPepper、8xPepper等。Cas13 sgRNA、Broccoli适配子、Pepper适配子的核苷酸序列分别如下：

Cas13 sgRNA：GUUGUGGAAGGUCCAGUUUUGAGGGGCUAUUACAAC(SEQ ID NO.1)；

Broccoli适配子：GAGACGGUCGGGUCCAGAUAUUCGUAUCUGUCGAGUAGAGUGUGGGCUC(SEQID NO.2)；

Pepper适配子：CCAAUCGUGGCGUGUCGGCCUGCUUCGGCAGGCACUGGCGCCG(SEQ IDNO.3)。