[发明专利]质谱流式技术用评估NK细胞培养纯度的检测试剂盒及应用

权利要求书

1.质谱流式技术用评估NK细胞培养纯度的检测试剂盒，其特征在于；本发明公开可检测人体NK细胞免疫状态的试剂盒，所述试剂盒可用于监测人体免疫状态的变化以及评估其NK细胞培养纯度，所述试剂盒包含被标记的37种抗体；

所述37种抗体为单克隆抗体CD45、CD196/CCR6、CD123/IL-3R、CD11c、CD16、CD45RO、CD27、CD183/CXCR3、CD185/CXCR5、CD28、TCRgd、CD294/CRTH2、CD197/CCR7、CD14、CD3、CD20、HLA-DR、CD127/IL-7Ra、CD69、CD137、CD62L、Ki67、NKG2A、NKG2D、NKp30、CD19、CD4、CD8、CD45RA、CD161、CD194/CCR4、CD25/IL-2R、CD38、CD56/NCAM、CD66b、CD11b和NKp44。

2.一种权利如要求1所述质谱流式技术用评估NK细胞培养纯度的检测试剂盒的应用，其特征在于，其包括以下步骤；

S1.血液收集；

S2.FcR-封闭；

S3.染色，染色共分为两个部分，第一部分进行膜蛋白染色，第二部分进行胞浆蛋白染色；

S4.上机；

S5.数据分析和解读。

3.根据权利要求2所述质谱流式技术用评估NK细胞培养纯度的检测试剂盒的应用，其特征在于：其包括以下步骤；

1)收集5ml的血液于抗凝管中，以防止凝血和血小板活化，在一支空的15ml离心管中，加入5ml血液和等体积D-Hanks液，混合摇匀，另取一支空的50ml离心管，向其中加入10mlFicoll，再用滴管吸取稀释血液，沿管壁缓慢滴加于Ficoll上，形成分层，室温，刹车速度设为1，400gx20min进行密度梯度离心；

2)样本加入50μl block mix，重悬细胞，室温放置10min，孵育结束后不必去除封闭液；

3)膜蛋白染色：向封闭结束后的每管样本中加入50μlantibody cocktail，37种抗体组合，加上的50μl封闭液，此时体积为100μl，轻柔吹打混匀细胞，室温放置15min，轻柔vortex混匀细胞，继续室温放置15min，每管样本中加入2mlCellStaining Buffer，室温离心300gX5min，弃上清；

胞浆蛋白染色：配置FixI溶液，将5XFixI母液用PBS稀释到1X，每份样本需要1ml1XFixI溶液，每管加入1ml1XFixI溶液，混匀，室温放置10-30min，每管中加入2mlPerm-Sbuffer，离心800gX5min，弃上清，每管细胞中加入50μlantibody cocktail，轻柔涡旋震荡细胞，室温放置30min，每管加入2ml Cell Staining Buffer，室温离心800gX5min，弃上清，重复步骤上述，弃上清；

4)室温离心800gX5min，弃上清，每管样本加入2ml Cell Staining Buffer重悬细胞，室温离心800gX5min，弃上清，每管样本加入1ml Cell Acquisition Solution，CAS溶液重悬细胞，取10ul进行细胞计数，其余悬液室温离心800gX5min，弃上清，细胞沉淀放置冰上，直到上机前进行重悬，根据细胞计数结果，上机前，用CAS溶液将细胞重悬为1.0X10⁶/mlHelios的悬液，向细胞悬液中加入10％EQ Beads，开机质控-上机采集数据WBInjector；

5)仪器直接收集到的数据是最原始数据，在进行数据分析之前需要进行一些处理。

4.根据权利要求3所述质谱流式技术用评估NK细胞培养纯度的检测试剂盒的应用，其特征在于：所述离心完成后，离心管中由上至下细胞分四层，第一层，血浆层，第二层，单个核细胞层，第三层，透明分离液层，第四层：红细胞层，且用滴管吸取单个核细胞层，清洗。

5.根据权利要求3所述质谱流式技术用评估NK细胞培养纯度的检测试剂盒的应用，其特征在于：所述10％EQBeads由1份EQbeads和9份CAS配制而成，且用带35um滤网的流式管过滤细胞悬液。