[发明专利]一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法

权利要求书

1.一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：

步骤S1：引物设计与合成；

步骤S2：SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag表达载体的构建；

步骤S3：猪SLA-2真核表达载体的构建与鉴定；

步骤S4：无内毒素质粒大量提取；

步骤S5：293T细胞培养；

步骤S6：慢病毒包装，四种质粒与Opti-MEM I培养基按照以下比例：

步骤S7：慢病毒感染sT2细胞及筛选；

步骤S8：Western blotting检测目的基因质粒表达。

2.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，步骤S4具体包括：

(1)从-80℃冰箱中取出保存的空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)菌种和构建的荷包猪真核表达载体SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH、SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH的菌种以及慢病毒包装时所需的psPAX2、pMD2.G两个辅助质粒的菌种，分别用接种环“#”字划线法到Amp⁺抗性的LB固体培养基中，37℃正面放置15-30min，待菌液被培养基完全吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h；待长出单菌落后，分别用10μL的枪头挑取单菌落接种到5mL Amp⁺LB液体培养基中，标记后放置于摇床中，37℃200rpm震荡培养8h；

(2)按照10％的比例将预先培养好的6种菌液分别再次接种到50mL Amp⁺LB液体培养基中,标记后放置于摇床中，37℃200rpm震荡培养16-18h；

(3)提取质粒之前，首先进行柱平衡：将CP4吸附柱放入2mL收集管中，加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min弃掉收集管中废液，吸附柱重新装回；

(4)取15mL过夜培养的菌液放入15mL离心管中，12000rpm 1min离心后，将菌体沉淀转移到1.5mL EP管中，尽量去除上清液；

(5)取500μL含RNaseA的溶液P1加入菌体沉淀中，用枪吹打彻底使菌体悬浮；

(6)加入500μL溶液P2，快速温和颠倒离心管8次，使菌体充分裂解形成清亮粘稠溶液，此过程不能超过5min；

(7)缓慢加入500μL溶液P4，立即缓慢温和颠倒离心管8次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，室温静置10min，12000rpm离心10min，若上清中还有沉淀，再次离心至无沉淀；

(8)过滤柱CS放置在新的收集管中，加入上清液于柱中，12000rpm离心3min，将收集管中的过滤液收集；

(9)滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下混匀颠倒后，转移到先前已平衡的吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；

(10)吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；

(11)吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，加入无水乙醇，室温静置5min后12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体，此步骤重复两次；

(12)将吸附柱CP4放入空收集管中，12000rpm离心2min，目的是除去吸附柱中残留的漂洗液；

(13)将吸附柱CP4重新放置在一个灭菌1.5mL EP管中，向吸附膜中间加入60μL去离子水，50℃烘箱中放置2min，12000rpm离心2min将质粒收集到EP管中，取1μL进行浓度测量后，分装保存于-20℃，测定浓度，无蛋白质污染后进行下一步骤。