[发明专利]一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA‑2基因及其制备方法。我们构建了SLA‑2‑HB01、SLA‑2‑HB01‑Flag和SLA‑2‑HB01‑3×Flag真核表达载体，并经过无内毒素质粒的提取获得纯度较高的目的基因质粒，通过与psPAX2和pMD2.G混合瞬时转染293T细胞获得高滴度的慢病毒颗粒。分别收获SLA‑2‑HB01、SLA‑2‑HB01‑Flag和SLA‑2‑HB01‑3×Flag病毒，分别感染sT2细胞，经过筛选和Western blotting检测，证实成功构建SLA‑2‑HB01/sT2、SLA‑2‑HB01‑Flag/sT2和SLA‑2‑HB01‑3×Flag/sT2细胞系，并均优势表达SLA‑2‑HB01。另外，Western blotting实验也证实PK15细胞、sT2细胞和已转染sT2细胞中β2m蛋白表达量基本一致，说保守的轻链β2m在细胞内表达量稳定；上述数据为后续表位筛选奠定基础。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法。

背景技术

MHC是集中于某一染色体，编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因簇，呈高度多态性，是目前已知最丰富的基因系统。MHC分子在调节和启动机体免疫应答中发挥重要作用，如动物的免疫识别、对疾病的抵抗能力、免疫系统的调节等，很大程度上均依赖于MHC基因，其生物学功能与物种的生存息息相关，是免疫学研究最活跃的领域之一。

猪是用于研究MHC功能的重要动物模型。编码猪MHC的基因，又称为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)，而关于SLA基因区域的表达调节研究非常少。SLA位于猪第7号染色体短臂着丝粒两端7p1.1位置，大多数SLA基因组区域分布有三个典型的基因簇：SLA I类，II类和III类，且基因组大小共约2Mb，是迄今为止检测到哺乳动物MHC中最短且是唯一已知的跨着丝粒的MHC。

SLAI类基因簇的长度约1.1Mb，主要包括经典I类基因(Ia)、I类相关基因(Ib)和I类相关诱生性抗性基因(Ic)。已经有超过100个经典的SLAI类等位基因被确定。SLAI包括重链和轻链，其中重链包括SLA-1，SLA-2和SLA-33个功能性基因，具有表达完整的SLA I类基因结构的功能，并具有多态性；而轻链β2m非常保守，在抗原表位存在下，与重链以非共价键结合，维持SLAI的稳定。SLA-1和SLA-3的基因序列具有高度相似性，所编码的前导链均包含21个氨基酸，5′和3′端非翻译区也高度同源。SLA-2基因编码的前导链则由24个氨基酸组成，5′和3′端非翻译区与SLA-1、SLA-3存在区别。已发现SLA-2基因座具有较高的表达水平，这意味着SLA-2分子在免疫过程中发挥主导地位。SLA-2是SLAI类分子的功能基因，能表达完整的SLAI类分子，具有递呈抗原肽的功能。

在构建猪SLA-2真核表达载体时，eGFP可以作为报告基因，因为eGFP可以在宿主细胞内高效表达，且荧光强度也便于在荧光显微镜下观察慢病毒包装及感染宿主细胞的情况。但如果eGFP与MHC I类分子融合表达时，影响目的基因的定位与功能，原因为：1、eGFP太大，影响天然蛋白的构象；2、也可能与定位相关的信号肽刚好在N端或C端，从而影响目的基因的定位；3、也可能目的蛋白过表达，过表达后可能没有递呈肽类的功能。前期研究发现在MHC I蛋白分子的N端均存在一段由21个氨基酸残基组成的信号肽，所以为了避免ER腔面上的信号肽酶将荧光蛋白切除，在真核细胞分泌型蛋白及细胞膜蛋白质的N端一般都有16～26个氨基酸组成的信号肽，可引导蛋白质的跨膜转移或定位。慢病毒真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)为双启动子载体，CMV启动子驱动目的基因的高水平表达，EF1α启动子驱动eGFP报告基因和抗性基因转录为双顺反子，这样避免eGFP与SLA-2融合表达，且表达的外源蛋白结构较贴近天然构象的蛋白，保留信号肽在细胞中的定位功能。